腫瘤壞死因子α(TNFα)誘導RIP1激酶依賴的Bid剪切介導L929-A細胞死亡及其調(diào)控機制.pdf

1、程序性細胞死亡可以分為I型細胞凋亡、II型細胞自噬及III型細胞程序性壞死。細胞凋亡在胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和癌癥等生理和病理狀態(tài)中都發(fā)揮很重要的作用。在經(jīng)典凋亡途徑中，死亡受體通路及線粒體通路激活均可通過活化凋亡的執(zhí)行者Caspases，介導關(guān)鍵蛋白的剪切，引起一串生化反應事件使胞內(nèi)組分降解，介導細胞死亡。細胞凋亡具有典型的特征性表型，包括染色體凝集、凋亡小體、膜泡及DNA片段化等。為了提供能量和營養(yǎng)循環(huán)，細胞形成了一種進化保

2、守策略—自噬，來降解長壽命胞質(zhì)蛋白和細胞器，當受到饑餓、低氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和氧化應激等刺激時，細胞就會通過自噬進行促存活，使細胞免于死亡。然而當刺激超過某一極限時，會出現(xiàn)大量的自噬小泡，從而引發(fā)細胞自噬死亡，或稱為Ⅱ型細胞死亡。
　　程序性壞死雖屬于程序性死亡，但卻與凋亡和自噬均具有特殊的細胞死亡形態(tài)不同，程序性壞死的細胞形態(tài)與普通壞死完全相同，在死亡過程中細胞會發(fā)生質(zhì)膜完整性喪失，細胞器及細胞發(fā)生腫脹，最后導致細胞溶解。
　

3、　TNFα在免疫紊亂和腫瘤發(fā)展的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，它可以誘導細胞存活、凋亡和程序性壞死。研究表明TNFα介導不同反應的關(guān)鍵取決于形成何種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導復合體。當TNFα與TNFR1結(jié)合后首先招募多種蛋白在胞膜區(qū)形成I型復合體，其中RIP1激酶在cIAPs的作用下發(fā)生K63泛素化修飾，介導NF-κB信號通路活化，促進細胞生存。而當RIP1在CYLD、A20或Smac模擬物(SmacM)作用下發(fā)生去泛素化修飾時，細胞內(nèi)會形成誘導細胞

4、死亡的II型復合體。其中由RIP1、FADD、Caspase-8及TRADD組成的復合體IIa，通過剪切活化Caspase-8，誘導細胞凋亡。而在RIP3激酶高表達的細胞中，當使用zVAD阻斷Caspase的活性時，RIP1與RIP3會結(jié)合，形成complex IIb(又稱為壞死復合體necrosome)，誘導細胞發(fā)生壞死。對比細胞凋亡和細胞壞死，通常Caspase抑制劑可以拮抗凋亡但促進壞死，而抑制RIP1激酶可以拮抗壞死但對凋亡沒有

5、影響。
　　L929纖維肉瘤細胞建系于1948年，是一種在國內(nèi)外實驗室被廣泛使用的細胞系。由于單獨使用TNFα即可誘導細胞死亡的發(fā)生，因而L929細胞被廣泛地應用于細胞死亡的實驗研究。但在眾多的實驗報道中TNFα既可以誘導細胞凋亡，也可以誘導細胞壞死以及細胞自噬，提示該細胞系的生物學特征在不同的實驗體系中可能并不相同。在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)來源于軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所免疫研究室的L929細胞（命名為L929-A）雖已在先前的報道

6、中被用于TNFα誘導細胞壞死的研究，但其細胞的死亡調(diào)控卻呈現(xiàn)既不同于經(jīng)典凋亡又不同于程序性壞死的特性，表現(xiàn)為RIP1激酶抑制劑Nec-1及泛Caspases抑制劑z-VAD均可拮抗TNFα誘導的細胞死亡，而敲低Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9或采用相關(guān)抑制劑卻不能拮抗細胞死亡，且細胞呈現(xiàn)非凋亡的死亡形態(tài)。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)L929-A細胞中存在由RIP1、Caspase-8和FADD蛋白組成的Ripoptoso

7、me復合體，且TNFα刺激后RIP1和Caspase-8之間的相互結(jié)合明顯增強，進而介導產(chǎn)生RIP1激酶活性依賴的Bid剪切，與經(jīng)典凋亡通路不同，RIP1激酶依賴的Bid剪切并非通過活化線粒體凋亡信號通路介導細胞死亡，本研究在此基礎上圍繞Bid剪切介導細胞死亡的分子機制展開。
　　首先分別檢測了TNFα對細胞生存率、細胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成及鈣離子濃度的影響。結(jié)果顯示TNFα可時間依賴地誘導L929-A細胞死亡，細胞死亡出現(xiàn)的

8、時間點是6小時，同時伴隨ROS及鈣離子濃度的升高。采用Nec-1或敲低RIP1蛋白來抑制RIP1激酶活性可以有效拮抗TNFα的細胞毒性。敲低Bid蛋白同樣可以完全拮抗TNFα的細胞毒性。
　　隨后通過胰蛋白酶濃度梯度消化法檢測了RIP1、Caspase-8和Bid蛋白的表達和線粒體定位，結(jié)果顯示RIP1、Caspase-8和Bid蛋白均定位在線粒體外膜上，提示線粒體可能是Bid蛋白的剪切位點。此外研究發(fā)現(xiàn)在TNFα處理后3小時，細

9、胞尚未出現(xiàn)明顯活性改變之前，伴隨Bid蛋白剪切，線粒體呼吸鏈復合體III的活性受到抑制，線粒體膜電位下降，ATP水平開始降低。繼而在TNFα處理6小時后出現(xiàn)胞內(nèi)ROS和鈣離子濃度顯著上升，導致細胞死亡。這些研究結(jié)果證實線粒體呼吸鏈復合體III的活性受到抑制是介導細胞死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由于敲低RIP1的表達或采用Nec-1抑制RIP1激酶活性以及敲低Bid蛋白均可以拮抗TNFα誘導的線粒體毒性，保護細胞免于死亡，進一步證實RIP1激酶依賴的

10、Bid剪切恰恰是啟動線粒體功能抑制和線粒體外膜通透性下降及ATP降低的誘因。
　　本研究的主要發(fā)現(xiàn)是線粒體呼吸鏈復合體III功能抑制在TNFα誘導L929-A細胞非經(jīng)典凋亡過程中的重要作用，明確了線粒體呼吸鏈復合體抑制會直接導致細胞供能受影響，影響線粒體膜電位穩(wěn)定；同時排除了ROS和胞內(nèi)鈣離子水平的變化是細胞死亡誘因的可能性。綜上所述，我們的研究進一步明確了TNFα誘導RIP1激酶依賴的Bid剪切介導L929-A細胞非經(jīng)典凋亡的分