Wip1介導(dǎo)的自噬調(diào)控及抗菌免疫機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究Wip1對宿主抗菌免疫的影響，并闡明其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1、構(gòu)建小鼠氣管灌注肺炎模型研究Wip1對小鼠抗菌作用的影響，并用ELISA檢測BALF中炎癥因子的表達(dá)。
　　2、爬片和菌落涂板計(jì)數(shù)法檢測Wip1對細(xì)胞抗菌能力的調(diào)控作用。用ELISA檢測細(xì)胞上清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)情況。Western Blot檢測Wip1對NF-κB以及p38MAPΚ信

2、號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　3、構(gòu)建GFP-LC3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，然后加S.aureus刺激，最后用Confocal觀察腹腔巨噬細(xì)胞自噬情況；通過電鏡直接觀察細(xì)胞自噬體以及自噬溶酶體；Western Blot檢測LC3-II/LC3–I比率的變化來探究Wip1對自噬的影響。
　　4、腹腔巨噬細(xì)胞用探針標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測Wip1對ROS、mROS的表達(dá)的調(diào)控。同時(shí)用Western Blot和Confocal檢測Mit

3、o-tempo對自噬的影響。
　　5、先用ROS抑制劑、自噬激動(dòng)劑對小鼠進(jìn)行氣管灌注的預(yù)處理，然后氣管灌注S.aureus，最后菌落涂板計(jì)數(shù)以及ELISA檢測自噬對宿主抗菌免疫的影響。
　　結(jié)果：
　　1、與WT小鼠相比Wip1-/-小鼠細(xì)菌清除能力更弱，同時(shí)BALF中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平更高。
　　2、與WT腹腔巨噬細(xì)胞相比Wip1-/-腹腔巨噬細(xì)胞對細(xì)菌清除能力更弱，同時(shí)炎癥因子

4、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平更高。
　　3、與WT腹腔巨噬細(xì)胞相比Wip1-/-腹腔巨噬細(xì)胞在S.aureus刺激后ROS、mROS表達(dá)水平更低。
　　4、mROS的抑制劑Mito-tempo處理細(xì)胞后LC3-II的表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)Confocal觀察到GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物明顯減少。
　　5、ROS抑制劑處理小鼠后，小鼠的抗菌能力降低同時(shí)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)；自噬激動(dòng)劑處理小鼠后小鼠的抗菌能力增強(qiáng)炎癥反應(yīng)