miRNAs介導(dǎo)的自噬抑制在類鼻疽桿菌感染免疫逃逸中的作用機(jī)制研究.pdf

1、類鼻疽(Melioidosis)是由類鼻疽桿菌（Burkholderia pseudomallei，全稱為類鼻疽伯克霍爾德氏菌）所引起的一種人獸共患傳染病。該疾病可通過(guò)呼吸道、消化道、經(jīng)皮傳播，主要侵犯人體肺部，可造成肺炎、肺膿腫以及肺部空洞，還可引起皮膚、肝臟、脾臟等多器官膿腫，嚴(yán)重者可快速發(fā)展為敗血癥，由于其診斷難、致病強(qiáng)、治療難、潛伏長(zhǎng)，死亡率高達(dá)40％;其流行區(qū)域主要集中分布在南、北緯二十度內(nèi)，涵蓋澳大利亞、新加坡、越南、柬埔寨

2、、老撾、馬來(lái)西亞、泰國(guó)東北部等地區(qū)以及我國(guó)海南、香港、臺(tái)灣、廣東等南海及臺(tái)海等主要戰(zhàn)略方向，現(xiàn)越來(lái)越多的證據(jù)表明它是一種正在擴(kuò)散的人獸共患傳染病。海南國(guó)際旅游島的開(kāi)發(fā)、“一帶一路”的建設(shè)以及南海海洋主權(quán)維權(quán)和經(jīng)濟(jì)安全保障等已上升至國(guó)家戰(zhàn)略要求，加強(qiáng)類鼻疽研究具有重要的社會(huì)意義和軍事價(jià)值。深入研究B.pseudomallei感染致病機(jī)理、發(fā)展新的有效的B.pseudomallei感染治療手段迫在眉睫。
　　B.pseudomalle

3、i作為胞內(nèi)感染病原菌，有效逃逸機(jī)體免疫清除是B.pseudomallei感染與致病的前提。天然免疫作為人體抵御病原微生物侵襲的第一道防線，在抗感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自噬作為天然免疫中重要的組成部分，同時(shí)也作為機(jī)體自我保護(hù)的生理學(xué)行為，在抗病原微生物感染以及其導(dǎo)致的炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在類鼻疽桿菌的自噬研究中，早期發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生自噬，但隨著感染的持續(xù)，自噬出現(xiàn)抑制，RAW2

4、64.7細(xì)胞對(duì)B.pseudomallei清除能力減弱。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，B.pseudomallei感染肺上皮細(xì)胞A549后，自噬水平較未感染組明顯減弱;通過(guò)mRNA表達(dá)譜芯片篩選發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因ATG10下調(diào)最顯著。那么，B.pseudomallei是如何調(diào)控及抑制自噬，以利于其在宿主細(xì)胞中的存活和復(fù)制，使得機(jī)體不能有效清除B.pseudomallei，從而導(dǎo)致持續(xù)性感染的呢？
　　miRNAs作為病原與宿主相互作用的信號(hào)

5、調(diào)節(jié)分子，可通過(guò)介導(dǎo)清除病原體的自噬反應(yīng)，發(fā)揮抗病原微生物的感染免疫調(diào)節(jié)作用。為了探究B.pseudomallei感染過(guò)程中調(diào)控自噬的具體機(jī)制，以及miRNAs是否參與、如何參與自噬調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，我們以肺上皮細(xì)胞A549為細(xì)胞模型，開(kāi)展了B.pseudomallei感染A549細(xì)胞后miRNA表達(dá)譜芯片的篩選，對(duì)上調(diào)的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種未被報(bào)道的miRNAs: MIR4458、MIR4667-5p、MIR466

6、8-5p，它們可在3個(gè)不同的感染時(shí)間點(diǎn)分別靶向自噬信號(hào)通路的關(guān)鍵分子ATG10，提示我們B.pseudomallei可能通過(guò)改變宿主細(xì)胞的miRNAs表達(dá)譜，干擾宿主細(xì)胞自噬，實(shí)現(xiàn)逃避機(jī)體免疫清除的目的。因此，明確這些miRNAs介導(dǎo)的自噬抑制在類鼻疽桿菌感染免疫逃逸中的機(jī)制，將有助于開(kāi)發(fā)作用于miRNAs或其靶標(biāo)的新的治療手段，尤其是針對(duì)類鼻疽桿菌此種耐藥性強(qiáng)、胞內(nèi)感染的病原，臨床意義更為重要。
　　研究目的：
　　1.明

7、確B.pseudomallei感染A549細(xì)胞后自噬受抑的生物學(xué)現(xiàn)象;
　　2.明確B.pseudomallei感染A549細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白ATG10的表達(dá)變化;
　　3.探討MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p負(fù)性調(diào)控自噬的具體機(jī)制以及對(duì)細(xì)胞清除胞內(nèi)B.pseudomallei的影響;
　　4.探討B(tài).pseudomallei感染對(duì)MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p轉(zhuǎn)錄

8、調(diào)控的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.B.pseudomallei感染A549細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞自噬的影響
　　首先建立B.pseudomallei感染A549細(xì)胞模型，通過(guò)透射電鏡、Western blot、激光共聚焦檢測(cè)B.pseudomallei感染A549細(xì)胞后細(xì)胞自噬水平變化情況;再者，藥物激活或抑制自噬的條件下，通過(guò)細(xì)菌胞內(nèi)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)自噬對(duì)A549細(xì)胞清除胞內(nèi)B.pseudomallei能力的影響。

9、　　2.B.pseudomallei感染A549細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG10下調(diào)特點(diǎn)研究
　　通過(guò)mRNA表達(dá)譜芯片篩選，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白ATG10下調(diào)最明顯;結(jié)合表達(dá)譜芯片篩選結(jié)果，在mRNA和蛋白水平分析ATG10的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn);同時(shí)，構(gòu)建ATG10真核表達(dá)質(zhì)粒，回復(fù)下調(diào)的ATG10后，觀察并檢測(cè)自噬和細(xì)菌清除的變化。
　　3.MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p通過(guò)ATG10介導(dǎo)抑制自噬的機(jī)制研究<

10、br>　　結(jié)合miRNA表達(dá)譜芯片篩選和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p可靶向自噬相關(guān)基因ATG10;首先構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體進(jìn)一步鑒定ATG10是MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的靶基因;分別過(guò)表達(dá)或抑制MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p，通過(guò)Western blot、激光共聚焦以及胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)觀察miRNAs對(duì)自噬和細(xì)菌清除的影響

11、。
　　4.B.pseudomallei感染549細(xì)胞后上調(diào)MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)制研究
　　利用UCSC生物信息學(xué)軟件分析和預(yù)測(cè)MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)均含有較大的CpG島;首先通過(guò)BSP和DNMT活性檢測(cè)，觀察B.pseudomallei感染后MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的

12、CpG島甲基化水平改變;再者，利用去甲基化藥物5-Aza-CdR處理，通過(guò)MSP和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)降低甲基化水平對(duì)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.B.pseudomallei感染A549細(xì)胞后自噬受抑
　　通過(guò)透射電鏡、Western blot、激光共聚焦實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染A549細(xì)胞后自噬受抑;另外，在誘導(dǎo)或抑制自噬的條件

13、下，通過(guò)胞內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激活自噬可以增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)B.pseudomallei的胞內(nèi)清除能力。
　　2.B.pseudomallei通過(guò)下調(diào)ATG10抑制自噬
　　通過(guò)mRNA表達(dá)譜芯片篩選，發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染后自噬相關(guān)蛋白ATG10下調(diào)最明顯;利用qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分析，ATG10在mRNA和蛋白水平上均發(fā)生明顯下調(diào);同時(shí)，過(guò)表達(dá)ATG10可增強(qiáng)細(xì)胞自噬以及對(duì)B.pseudo

14、mallei的胞內(nèi)清除能力。
　　3.B.pseudomallei通過(guò)上調(diào)MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p抑制自噬
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析以及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，預(yù)測(cè)并鑒定了ATG10是MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p的靶基因;分別過(guò)表達(dá)或抑制這3個(gè)miRNA后，發(fā)現(xiàn)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p通過(guò)

15、ATG10介導(dǎo)了抑制宿主細(xì)胞自噬以及對(duì)B.pseudomallei胞內(nèi)清除能力。
　　4.B.pseudomallei感染后引起的MIR4458、MIR4667-5p、MIR668-5p啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化水平降低與其表達(dá)調(diào)控有關(guān)
　　通過(guò)BSP和DNMT活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染后MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的CpG島甲基化水平降低;同時(shí)，去甲基化藥物5-Aza-CdR

16、處理后，MSP分析MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的CpG島發(fā)生去甲基化，進(jìn)一步qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的表達(dá)均增加。
　　研究結(jié)論：
　　B.pseudomallei感染可通過(guò)甲基化調(diào)控方式，誘導(dǎo)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的上調(diào)，進(jìn)而實(shí)時(shí)、連續(xù)的抑制其靶基因ATG10的表達(dá)，負(fù)性調(diào)控自噬，從而影響宿主細(xì)胞對(duì)B.