幽門螺桿菌CagA抑制胃上皮細(xì)胞自噬及其感染引起的miR-222-146a上調(diào)在胃相關(guān)疾病發(fā)生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子,與胃粘膜淋巴組織淋巴瘤和胃癌的發(fā)病密切相關(guān),闡明致病機(jī)制對(duì)預(yù)防和控制其感染引起的相關(guān)疾病具有重要的理論指導(dǎo)意義。
　　H.pylori的感染與致病,是一個(gè)與機(jī)體相互斗爭的過程。自噬在抗病原微生物感染以及其導(dǎo)致的炎癥中發(fā)揮重要作用。自噬受到抑制,可以促進(jìn)炎性因子的釋放,引起炎癥反應(yīng),導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。一方面,H.pylori感

2、染胃上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)自噬,通過自噬降解病原體或其分泌的毒性分子起到保護(hù)胃上皮細(xì)胞的作用;另一方面,H.pylori為了達(dá)到感染和致病目的,存在某種機(jī)制對(duì)抗自噬。本研究提出CagA負(fù)性調(diào)控幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞自噬在慢性胃炎發(fā)生中的作用機(jī)制:H.pylori感染可活化胃粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)肝細(xì)胞生長因子(HGF)的受體c-Met,磷酸化c-Met可與通過Ⅳ分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至胃上皮細(xì)胞內(nèi)的CagA發(fā)生相互作用,啟動(dòng)了其下游的PI3K/Akt信號(hào)途徑

3、的活化,通過調(diào)節(jié)自噬通路中的信號(hào)蛋白mTOR而發(fā)揮抑制自噬的作用,從而影響到自噬對(duì)胃上皮細(xì)胞保護(hù)作用,導(dǎo)致CagA陽性H.pylori菌株胃上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)較重,引起慢性胃炎、消化性潰瘍,甚至胃癌等疾病。
　　miRNAs作為一類新的癌基因或抑癌基因,其表達(dá)失衡與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。前期研究中,我們通過芯片分析H.pylori感染胃上皮細(xì)胞miRNAs的變化,發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的miR-222表達(dá)上調(diào),而其靶基因RECK作

4、為一種抑癌基因,可以負(fù)性調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP),抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,其在胃癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)缺失,與胃癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此,我們推測miR-222可能是一個(gè)與H.pylori感染和胃癌發(fā)生密切相關(guān)的癌基因。H.pylori感染能夠誘導(dǎo)miR-222的高表達(dá),而miR-222可能通過抑制下游抑癌基因RECK的表達(dá),調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡,促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。
　　H.pylori可以在人體特殊的復(fù)雜多變的胃環(huán)境中長期定居

5、,其慢性持續(xù)性感染在所致疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年來,越來越多的證據(jù)顯示miRNAs在多個(gè)環(huán)節(jié)參與調(diào)控機(jī)體固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫反應(yīng),在宿主抗病原微生物感染時(shí)扮演重要的角色。前期研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染相關(guān)的miR-146a通過抑制靶基因IRAK1、TRAF6和COX-2的表達(dá),降低NF-κB的活性,從而抑制H.pylori感染導(dǎo)致的炎癥因子的釋放。為深入研究在H.pylori感染誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)過程中究竟什么因

6、素起關(guān)鍵作用,我們觀察了H.pylori感染相關(guān)炎性細(xì)胞因子以及H.pylori毒素蛋白CagA在胃上皮細(xì)胞中對(duì)miR-146a表達(dá)的影響。
　　【研究目的】
　　1.評(píng)價(jià)H.pylori感染胃上皮細(xì)胞誘導(dǎo)自噬發(fā)生的過程中CagA對(duì)自噬的抑制作用;觀察自噬抑制對(duì)H.pylori感染引起的炎癥反應(yīng)的影響;探討CagA負(fù)性調(diào)控H.pylori誘導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞自噬的機(jī)制。
　　2.分析H.pylori感染胃上皮細(xì)胞、胃粘膜組

7、織以及胃癌細(xì)胞株、胃癌組織中miR-222的表達(dá);篩選并鑒定miR-222的靶基因,探討其致癌機(jī)制。
　　3.觀察H.pylori相關(guān)炎性因子IL-8、TNF-α以及IL-1β刺激HGC-27細(xì)胞對(duì)miR-146a表達(dá)影響;評(píng)價(jià)miR-146a對(duì)H.pylori感染誘導(dǎo)炎癥因子釋放的影響;探討毒力因子CagA對(duì)H.pylori感染誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)影響。
　　【研究方法】
　　1.幽門螺桿菌CagA抑制胃上皮細(xì)

8、胞自噬及其在慢性胃炎發(fā)生中的作用機(jī)制研究Western-blot、激光共聚焦、電鏡以及流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測Hp-WT或Hp-△
　　CagA感染人胃上皮細(xì)胞自噬模型和臨床胃粘膜標(biāo)本自噬水平;檢測體外過表達(dá)CagA對(duì)Rapamycin誘導(dǎo)自噬的影響;使用化學(xué)藥物法抑制自噬或利用siRNA技術(shù)阻斷自噬,ELISA分別檢測Hp-WT和Hp-△CagA兩種菌株感染誘導(dǎo)炎癥因子分泌的水平,熒光素酶法檢測NF-κB熒光素酶報(bào)告基因活性;Wes

9、tern-blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑是否參與了H.pylori感染過程中CagA對(duì)自噬的抑制作用;利用siRNA沉默c-Met表達(dá),Western-blot、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞技術(shù)檢測H.pylori感染誘導(dǎo)的自噬情況。
　　2.miR-222高表達(dá)在幽門螺桿菌感染誘發(fā)胃癌中的作用及機(jī)制研究
　　RT-PCR檢測H.pylori感染胃上皮細(xì)胞系前后以及H.pylori感染患者胃粘膜組織、胃癌細(xì)胞株

10、以及胃癌組織中miR-222的表達(dá);CCK-8法檢測miR-222對(duì)兩種胃癌細(xì)胞株增殖的影響,分析miR-222對(duì)兩種胃癌細(xì)胞株克隆形成的影響;利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、GFP熒光抑制實(shí)驗(yàn)、Westernblot鑒定靶基因;利用RT-PCR技術(shù)檢測靶基因與miR-222胃癌組織樣本中的表達(dá)水平及相關(guān)性;CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)分別檢測沉默RECK表達(dá)是否可以模擬過表達(dá)miR-222對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖和克隆形成的影響。3.H.pylori感

11、染HGC-27細(xì)胞miR-146a表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制初步研究。
　　利用RT-PCR技術(shù)檢測IL-8、TNF-α以及IL-1β刺激HGC-27細(xì)胞后miR-146a表達(dá)情況;siRNA沉默IL-8、TNF-α和IL-1β的表達(dá),RT-PCR技術(shù)檢測H.pylori感染后miR-146a表達(dá);熒光素酶法檢測IL-8、TNF-α或IL-1β刺激后NF-κB熒光素酶報(bào)告基因活性;分別用IL-8、TNF-α或IL-1β刺激NF-κB抑制劑(BA

12、Y-117082)處理過的HGC-27細(xì)胞,RT-PCR技術(shù)檢測miR-146a表達(dá);RT-PCR和ELISA技術(shù)分別檢測過表達(dá)miR-146a對(duì)H.pylori感染炎癥因子mRNA和蛋白水平;CagA陽性或陰性H.pylori菌株感染HGC-27細(xì)胞,RT-PCR技術(shù)檢測miR-146a表達(dá);轉(zhuǎn)染HGC-27細(xì)胞pEGFP-C1-CagA質(zhì)粒,熒光顯微鏡和免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR技術(shù)檢測內(nèi)源性高表達(dá)CagA對(duì)miR-146a

13、的表達(dá)影響。
　　【主要結(jié)論】
　　1.CagA具有抑制H.pylori誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞自噬的作用;抑制自噬可以增強(qiáng)Hp-△CagA感染介導(dǎo)的炎癥程度;CagA可能通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑介導(dǎo)了H.pylori感染過程中對(duì)自噬的抑制作用;c-Met分子可能參與了CagA抑制H.pylori感染胃上皮細(xì)胞自噬過程。
　　2.無論是體外還是體內(nèi)H.pylori感染均能誘導(dǎo)miR-222的表達(dá)上調(diào);miR-222

14、在胃癌細(xì)胞株和胃癌組織中均呈高表達(dá);RECK為miR-222的新靶基因;H.pylori感染誘導(dǎo)的miR-222的高表達(dá),可能通過靶向抑制RECK蛋白的表達(dá),來發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用;胃癌組織中,miR-222與RECK轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量呈現(xiàn)很好的負(fù)相關(guān)。
　　3.H.pylori相關(guān)炎性因子刺激胃上皮細(xì)胞HGC-27誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)上調(diào),但對(duì)于miR-146a的高表達(dá)為非必要條件;NF-κB活化參與了IL-8、TNF-α

15、以及IL-1β誘導(dǎo)miR-146a高表達(dá);過表達(dá)miR-146a可以抑制H.pylori感染相關(guān)炎癥因子的釋放;H.pylori感染對(duì)miR-146a的誘導(dǎo)不依賴于毒素蛋白CagA。
　　【研究意義】
　　1.本研究首次提出幽門螺桿菌CagA作為一種負(fù)性調(diào)控因子,通過抑制自噬引起慢性胃炎的新觀點(diǎn),并在體內(nèi)外從現(xiàn)象到機(jī)制進(jìn)行了探討,為深入理解和認(rèn)識(shí)H.pylori慢性感染致病機(jī)制、尋找H.pylori感染有效防治手段提供了新的

16、視角。
　　2.miR-222可能參與H.pylori感染誘發(fā)胃癌的過程,可以作為胃癌診斷或治療的靶點(diǎn),在H.pylori感染與胃癌形成的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,研究為闡明H.pylori的致癌機(jī)制提供了新線索。
　　3.H.pylori感染引起的炎癥免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜且涉及諸多環(huán)節(jié)。
　　miRNAs在H.pylori感染的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本文對(duì)H.pylori感染誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制予以了初