TGF-β在胃癌免疫逃逸中作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　第一部分 TGF-β誘導胃癌細胞HLA-G表達機制的研究
　　研究目的：
　　研究TGF-β誘導胃癌細胞HLA-G的表達及可能作用機制。
　　研究方法：
　　通過臨床工作獲取山東大學齊魯醫(yī)院20例胃癌患者胃癌組織及癌旁組織標本，同時采集術前1天相應患者的外周血標本。所有患者術前檢查均未發(fā)現其他臟器腫瘤病變，均接受根治性胃癌切除手術，術前均未接受針對腫瘤的放療、化療及免疫

2、治療，所有腫瘤標本均經術后病理證實。經醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入實驗的胃癌患者均在術前簽署病情及實驗知情同意書。
　　1.研究數據來源:
　　2.組織標本以及特殊器械準備
　　3.組織病理學制備
　　4.相應外周血標本中可溶性HLA-G(sHLA-G)濃度檢測
　　5.通過ELISA對TGF-β和HLA-G的檢測
　　6.應用TGF-β kit、sHLA-Gkit檢測胃癌細胞TGF-β與HLA-G的

3、濃度。
　　7.統計分析
　　研究結果：
　　1.在實驗中對TGF-β及HLA-G的濃度進行了分析，發(fā)現通過皮爾森的回歸分析出一個強烈的正相關關系(R2=0.5455; P＜0.001)。
　　2.ELISA實驗分析表明TGF-β處理后48小時，HLA-G水平增高(*P＜0.05**P＜0.01)。
　　3.實驗發(fā)現隨著TGF-β逐步升高的濃度和處理時間的增加，結果顯示，HLA-G表達逐漸上調。
　　

4、研究結論:
　　1.在胃癌細胞以及組織中TGF-β及HLA-G呈高表達水平，統計學分析顯示兩者的表達呈相關性。
　　2.在胃癌中不同濃度TGF-β刺激能上調HLA-G不同程度表達。TGF-β表達和HLA-G的表達在胃癌組織中及外周血中的濃度呈顯著正相關。
　　3.TGF-β參與了胃癌組織中HLA-G的表達上調說明TGF-β和HLA-G在胃癌組織及外周血中的蛋白水平呈正相關;進一步闡明TGF-β不僅與胃癌的活化和轉移相關

5、，而且在普通外科領域可能成為判斷胃癌患者預后的指標之一應用于臨床實踐。
　　第二部分 通過抑制miR-152研究TGF-β在胃癌免疫逃逸作用及機制
　　研究目的:
　　通過抑制胃癌細胞miR-152研究TGF-β及HLA-G之間的關系，進一步探討胃癌TGF-β參與腫瘤免疫逃逸可能作用及機制。
　　研究方法:
　　在進行實驗前首先對待檢測細胞進行細胞復蘇，細胞消化等處理，達到一定要求方可進行細胞培養(yǎng)以及下一步

6、操作
　　1.常規(guī)細胞復蘇以及細胞培養(yǎng)，傳代
　　2.細胞轉染，質粒轉染
　　3.熒光素酶檢測
　　4.RNA分離，qRT-PCR以檢測HLA-G mRNA和TGF-β
　　在本實驗中我們采用Trizol法提取胃癌細胞中的總RNA，為了檢測HLA-GmRNA和TGF-β，按產品說明書使用SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase將oligo-dTprimers標定的RNA反轉錄入c

7、DNA，在本實驗中經對比以及檢索我們最終選用磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。為了檢測成熟的miR-152，用mirVanamiRNA Isolation kit提取小RNA，用小核RNA U6作為內參。然后在實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)中，ABI7300 SYBR預混料應用ExTaq酶來作為中介。之后按照Takara公司的ABI7300實時熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測以及整理結果，統計并分

8、析。采用比較閾值法對實驗數據進行相對定量分析。
　　5.分別對不同濃度以及時間的TGF-β及HLA-G濃度檢測以及miR-152表達的檢測.
　　用ELISA法檢測轉染后細胞株培養(yǎng)上清液，使用TGF-βELISA kit檢測不同濃度的TGF-β，采用sHLA-G儀器檢測可溶性HLA-G的濃度。然后檢測miR-152濃度并分析之間關系。
　　6統計分析
　　以上所統計結果我們所得數據以均數±標準差((X)±SD)表

9、示來進行。單因素方差分析或x2檢驗法分析組間的差異。用SPSS17.0統計學軟件進行統計分析。P＜0.05被認為差異有顯著統計學意義。
　　研究結果：
　　1.經應用不同濃度TGF-β（2.5，5或10ng/ml）24h刺激下，發(fā)現同時HLA-GmRNA表達不同程度上升(圖2B)。
　　2.經實驗在TGF-β高表達的細胞和干擾細胞株中檢測到了不同濃度的miR-152。而在試管（體外）中TGF-β能誘導miR-152顯著

10、下調（P＜0.01;圖3），說明在胃癌細胞TGF-β可能抑制miR-152。
　　3.在轉染48h后觀察，抑制的miR-152與HLA-G有較一致上升趨勢，這說明在胃癌BGC823和SGC7901細胞株中miR-152改變并調節(jié)了HLA-G的表達(圖4G)。
　　4.通過比較分析不同濃度miR-152和不同濃度的TGF-β對HLA-G表達的調節(jié)作用。結果顯示:miR-152下調HLA-G，TGF-β上調HLA-G（如圖4）。

11、經過細胞轉染24 h后，從熒光素酶檢測結果顯示HLA-G3'非翻譯區(qū)呈現負調節(jié)(圖4c)，同時觀察到Mut-HLA-G3'UTR沒有明顯的規(guī)律（圖4E、F）。
　　5.經處理應用不同的miR-152 mimics，miR-152 inhibitor以及negative controlRNA與miR-152 mimics control不同水平檢測發(fā)現抑制miR-152可以向上調節(jié)HLA-G表達，同時抑制TGF-β誘導HLA-G表達

12、的改變(*P＜0.05，**P＜0.01)。
　　6.經過檢測發(fā)現，在上調TGF-β濃度時，加入miR-152 mimics后則部分下調，間接說明HLA-G表達與miR-152成反比例關系（圖7A、B）(*P＜0.05，**P＜0.01)。作線形圖發(fā)現HLA-G濃度與miR-152成反比例關系(R2=0.5267; P＜0.001)。同時TGF-β濃度與miR-152成反比例關系(R2=0.5944; P＜0.001)。
　

13、　研究結論：
　　1.研究發(fā)現不同濃度的胃癌細胞TGF-β刺激可產生不同濃度的miR-152，反之亦然，說明兩者之間有交互影響。
　　2.通過分析以上結果可以發(fā)現通過抑制miR-152可促進胃癌細胞TGF-β的表達。實驗中發(fā)現在胃癌組織miR-152表達水平與TGF-β表現成反比。
　　3.HLA-G表達和miR-152濃度之間存在顯著負性相關。在本實驗中發(fā)現胃癌細胞株中miR-152呈低表達;實驗表明具有統計學差異。

14、
　　4.結果顯示抑制miR-152轉錄活性后，胃癌細胞中TGF-β可以誘導HLA-G的表達。這對胃癌細胞的活化起著重要作用并對進一步研究胃癌TGF-β免疫逃逸機制有重要的意義。
　　意義:經以上研究發(fā)現通過抑制miR-152轉錄活性可以增加胃癌TGF-β和HLA-G表達水平，該發(fā)現可能揭示胃癌TGF-β免疫逃逸機制。本次實驗在國內外已發(fā)表的實驗以及臨床研究中未見有報道。本實驗揭示miR-152通過抑制胃癌TGF-β誘導HL