lncRNAs HOTAIR參與胃癌免疫逃逸的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 lncRNAs HOTAIR在胃癌組織中的表達(dá)及可能作用機(jī)制
　　目的：研究HOTAIR在胃癌組織中的表達(dá)及可能作用機(jī)制。
　　方法：獲取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院60例胃癌患者癌組織及相應(yīng)癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5cm）標(biāo)本，同時(shí)采集相應(yīng)患者術(shù)前1天的外周血標(biāo)本。本研究符合《赫爾辛基宣言》標(biāo)準(zhǔn)，通過山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入患者均在手術(shù)前簽署知情同意書。
　　1

2、.胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中HOTAIR、miR-152及HLA-G的表達(dá)檢測
　　常規(guī)胃癌根治術(shù)后留取胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，編號后立即放入-80℃液氮罐冷凍備用。應(yīng)用Trizol法分別提取胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本的總RNA。為了檢測HLA-G mRNA和HOTAIR，按產(chǎn)品說明使用SuperScriptⅢ ReverseTranscriptase將oligo-dT primers標(biāo)定的RNA反轉(zhuǎn)錄入cDNA，用磷酸甘油酸脫

3、氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。為了檢測成熟的miR-152，用mirVana miRNA Isolation kit提取小RNA，用小核RNA U6作為內(nèi)參。用Takara公司的ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)實(shí)施實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測和收集數(shù)據(jù)。對每個(gè)樣品進(jìn)行重復(fù)檢測3次，并進(jìn)行溶解曲線檢測。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用比較閾值法（2-△△CT法）進(jìn)行相對定量分析。
　　2.相應(yīng)外周血標(biāo)本

4、中可溶性HLA-G(sHLA-G)濃度檢測
　　外周血標(biāo)本用乙二胺四乙酸(EDTA)做處理留取血漿后存放入-80℃液氮罐冷凍備用。測定前將血漿標(biāo)本在無血清培養(yǎng)基孵育48小時(shí)，然后用sHLA-G試劑盒按說明書使用檢測外周血中可溶性HLA-G的濃度。重復(fù)所有實(shí)驗(yàn)3次，然后計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，以此作為最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　3.生物信息學(xué)分析HOTAIR轉(zhuǎn)錄和miR-152之間的相互作用
　　用DIANA TOOLS對H

5、OTAIR轉(zhuǎn)錄和miR-152之間的相互作用進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　4.統(tǒng)計(jì)分析
　　所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±SD)表示。用Pearson's correlation法進(jìn)行相關(guān)分析。單因素方差分析或x2檢驗(yàn)法分析組間的差異。用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05被認(rèn)為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.HOTAIR在胃癌組織中的表達(dá)水平是癌旁組織的1.76倍。
　　2.HO

6、TAIR和HLA-G表達(dá)水平之間存在顯著正性相關(guān)(R2=0.57)，HOTAIR表達(dá)和HLA-G濃度之間也存在顯著正性相關(guān)(R2=0.582)。
　　3.HOTAIR轉(zhuǎn)錄中存在miR-152的三個(gè)潛在結(jié)合域，在這些結(jié)合域中常見的程序模塊序列“GCACUG”被“AAGAGA”代替，從而顯露一個(gè)Mut-HOTAIR用于接下來的突變研究。
　　4.miR-152在胃癌組織中的表達(dá)水平是癌旁組織的64％。HOTAIR和miR-152

7、表達(dá)呈顯著負(fù)性相關(guān)(R2=0.5168)。
　　結(jié)論：
　　1.胃癌組織中HOTAIR呈高表達(dá)水平。
　　2.HOTAIR水平和HLA-G在胃癌組織中的mRNA水平及外周血中的蛋白水平呈正相關(guān);HOTAIR參與了胃癌組織中HLA-G的表達(dá)上調(diào)。
　　3.HOTAIR轉(zhuǎn)錄中存在miR-152的三個(gè)潛在結(jié)合域，在這些結(jié)合域中常見的程序模塊序列“GCACUG”被“AAGAGA”代替，從而顯露一個(gè)Mut-HOTAIR用于

8、接下來的突變研究。
　　4.胃癌組織中miR-152呈低表達(dá)水平，且與HOTAIR呈顯著負(fù)相關(guān)。HOTAIR能負(fù)性調(diào)節(jié)miR-152的表達(dá)。
　　第二部分 lncRNAs HOTAIR在胃癌細(xì)胞免疫逃逸中的作用機(jī)制
　　目的：
　　研究HOTAIR參與胃癌細(xì)胞免疫逃逸的可能機(jī)制。
　　方法：
　　兩種人胃癌細(xì)胞株SGC7901和MGC-803均為中國科學(xué)院提供。
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　胃癌

9、細(xì)胞株SGC7901和MGC-803用含補(bǔ)充10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)和抗生素（1％鏈霉素/青霉素）的RMPI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)在37℃恒溫、含5％CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
　　2.HOTAIR高表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和小干擾RNA[siRNAs]
　　用pCDNA3.1載體構(gòu)建HOTAIR高表達(dá)質(zhì)粒，其引物序列forward:5'-CCAGTTCTCAGGCGAGAGCC-3';re

10、verse:5'-TrTATATTCAGG ACATGTAA-3'。采用定點(diǎn)誘變法對HOTAIR中miR-152結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變誘導(dǎo)，從而構(gòu)建Mut-HOTAIR質(zhì)粒。所有用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體經(jīng)擴(kuò)增后由DNA Midiprep kit提取。siRNAs及對照siRNA(si-NC)購買于lnvitrogen公司。
　　三個(gè)獨(dú)立的HOTAIR siRNAs序列為:
　　siHOTAIR-1: GAACGGGAGUACAGAG

11、AGAUU;
　　siHOTAIR-2: CCACAUGAACGCCCAGAGAUU;
　　siHOTAIR-3: UAACAAGACCAGAGAGCUGUU。
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　miR-152的高表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒及其對照RNA購買于GenePharma公司。SGC7901和MGC-803細(xì)胞(2.5×105)接種于6孔培養(yǎng)板上，孵育24小時(shí)后將HOTAIR質(zhì)粒、siHOTAIR序列、miR-152的高表達(dá)

12、質(zhì)粒以及干擾質(zhì)粒參照Lipofectamin2000說明書分別轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞中。
　　4.轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞株中HOTAIR、miR-152及HLA-G的表達(dá)檢測
　　采用Trizol法提取轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞中的總RNA。為了檢測HLA-G mRNA和HOTAIR，按產(chǎn)品說明書使用SuperScriptⅢReverse Transcriptase將oligo-dT primers標(biāo)定的RNA反轉(zhuǎn)錄入cDNA，用磷酸甘油酸脫氫酶(GA

13、PDH)作為內(nèi)參。為了檢測成熟的miR-152，用mirVana miRNA Isolation kit提取小RNA，用小核RNA U6作為內(nèi)參。用Takara公司的ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測和數(shù)據(jù)收集。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測，并進(jìn)行溶解曲線檢測。采用比較閾值法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。
　　5.轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞株SGC7901和MGC-8

14、03培養(yǎng)液中可溶性HLA-G濃度檢測
　　收集在無血清培養(yǎng)基中孵育48小時(shí)后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用sHLA-G試劑盒按說明書檢測培養(yǎng)上清液中可溶性HLA-G的濃度。重復(fù)所有實(shí)驗(yàn)3次，然后計(jì)算3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，以此作為最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.HOTAIR在兩組胃癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平:用HOTAIR高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均增長大約16.1倍，用于擾質(zhì)粒(si-HOTAIR)轉(zhuǎn)染后均下降約63％。
　　2.HL

15、A-G在兩組胃癌細(xì)胞內(nèi)的mRNA水平和蛋白水平:用HOTAIR高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均增長大約2倍，用干擾質(zhì)粒(si-HOTAIR)轉(zhuǎn)染后均下降約50％。
　　3.miR-152在兩組胃癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平:用HOTAIR高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均下降約52％，用si-HOTAIR轉(zhuǎn)染后均增長大約1.72倍，而Mut-HOTAIR對miR-152表達(dá)沒有顯著影響;用miR-152高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均增長約17.3倍，用miR-152干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均

16、下降約67％。
　　4.HLA-G在兩組細(xì)胞內(nèi)的mRNA水平和蛋白水平:用miR-152高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均下降約52％，用miR-152干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均增長大約2.2倍;用HOTAIR高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均增長約1.8倍，用siHOTAIR轉(zhuǎn)染后均下降約47％;而用mut-HOTAIR轉(zhuǎn)染后無明顯變化。
　　5.兩組胃癌細(xì)胞內(nèi)的HLA-G3'UTR活性:用miR-152高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均下降約51％，用miR-152干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

17、后均增長約1.75倍;用HOTAIR高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均增長約1.53倍，用siHOTAIR轉(zhuǎn)染后均下降約48％;而用mut-HOTAIR轉(zhuǎn)染后無明顯變化;用miR-152高表達(dá)質(zhì)粒與HOTAIR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后均下降約1.2％，用miR-152高表達(dá)質(zhì)粒與mut-HOTAIR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后均下降約52％。
　　結(jié)論：
　　1.HOT-AIR能促進(jìn)胃癌細(xì)胞HLA-G的表達(dá)。
　　2.胃癌細(xì)胞中，HOTAIR與miR152有直接