外膜蛋白18(Hp1125)參與幽門螺旋桿菌免疫逃逸機(jī)制分析.pdf

1、目的
　　 H.pylori(Helicobacterpylori，Hpylori)是一種能夠在人類的胃中成功定植的致病微生物，其長期定植可以引起多種胃部疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍，并有可能導(dǎo)致為腸化生、胃癌和粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤發(fā)生。H.pylori的感染率較高，約有50％的世界人口感染該菌，在我國H.pylori的感染率高達(dá)88.5％，而且一般為cagA陽性的高致病菌株，因此幽門螺桿菌感染所導(dǎo)致的疾病在我國更為普遍與嚴(yán)

2、重，世界衛(wèi)生組織認(rèn)為幽門螺桿菌感染是導(dǎo)致胃癌的I型致病因子，而我國是胃癌高發(fā)國家。
　　 宿主具有一系列的防御機(jī)制抵御H.pylori的感染，如胃蠕動、胃酸分泌、胃內(nèi)復(fù)雜多變的環(huán)境以及宿主的免疫反應(yīng)。然而，H.pylori能夠在胃粘膜成功定植，這歸因于其獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)，如分泌尿素酶。而且宿主免疫應(yīng)答可以誘導(dǎo)幽門螺桿菌應(yīng)激反應(yīng)并表達(dá)抗氧應(yīng)激的分子以及促進(jìn)吞噬體內(nèi)粗粒體的形成保護(hù)自身不被宿主清除。但是，過去的研究主要著眼于H.pyl

3、ori如何逃避宿主的先天免疫應(yīng)答，而其定植必然激活宿主的適應(yīng)性免疫。過去的研究已經(jīng)證實H.pylori對宿主樹突狀細(xì)胞(DCs)的成熟和功能有重要的影響，主要引起宿主Th1方向的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ對于H.pylori的定植有重要的影響，H.pylori在正常小鼠體內(nèi)的定植率明顯低于IFN-γ-/-小鼠中的定植率，這說明IFN-γ在清除幽門螺桿菌定植方面具有重要作用。然而，H.pylori是如何逃避宿主的適應(yīng)性免

4、疫，特別是如何逃避IFN-γ清除作用研究不多。雖然之前的研究結(jié)果暗示IFN-γ與H.pylori之間有相互作用，但是他們之間如何作用尚不清楚。
　　 H.pylori的膜中含有豐富的膜蛋白，有30多種，它們對離子運(yùn)輸、細(xì)菌粘附、滲透、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用，而且有些膜蛋白具有的獨(dú)特的免疫原性，還可以用來作為疫苗開發(fā)。根據(jù)對綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和土拉熱弗朗西絲菌(Francisella

5、novicida)外膜蛋白的研究，我們通過生物信息學(xué)的方法鎖定了本文所要研究的外膜蛋白-Hp1125，它和綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的OprF有較高的同源性，之前的研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)膜蛋白與IFN-γ具有靶向結(jié)合作用。而H.pylori的Hp1125是否與IFN-γ也具有結(jié)合作用尚沒有人研究。由于宿主的免疫反應(yīng)不利于H.pylori的生存和定植，那么宿主免疫應(yīng)答是

6、否會誘導(dǎo)細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答反應(yīng)，尤其是是否誘導(dǎo)調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答基因spoT表達(dá)，以及H.pylori的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答反應(yīng)是否參與調(diào)控其逃避IFN-γ所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答尚不明確。
　　 我們的研究主要探討外膜蛋白Hp1125在H.pylori適應(yīng)宿主IFN-γ中的機(jī)制，以及H.pylori的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答反應(yīng)在其中的作用，探究H.pylori逃逸宿主清除的機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療提供線索。
　　 方法
　　 1、體外實驗證實IFN-γ刺激

7、可以引起H.pylori的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答反應(yīng)。在體外用一定濃度的IFN-γ刺激培養(yǎng)至對數(shù)期的幽門螺桿1h、2h、4h、8h之后，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行Real-timePCR檢測spoT的表達(dá)。
　　 2、通過生物信息學(xué)的方法在H.pylori中查找綠膿桿菌膜(Pseudomonasaeruginosa)蛋白OprF的同源序列。我們在BLAST和BioCycdatabase中進(jìn)行蛋白序列比對和查找。
　　 3、通過

8、同源重組的方法在HP26695菌株中構(gòu)建Hp1125突變株。用pILL570質(zhì)粒、pUC18K2質(zhì)粒和PCR的方法構(gòu)建敲除質(zhì)粒。用驗證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)野生株，篩選成功插入Kanal抗性基因的單克隆。
　　 4、分析外膜蛋白Hp1125對H.pylori適應(yīng)IFN-γ的影響。用IFN-γ分別處理HP26695和Hp1125突變株1h、2h、4h、8h后，提取RNA進(jìn)行RT-PCR，然后進(jìn)行Real-timePCR檢測spoT的表

9、達(dá)變化;分別提取野生株HP26695和Hp1125突變株的膜蛋白，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)到PVDF膜后用5％的BSA封閉，用IFN-γ作為一抗，anti-IFN-γ作二抗，然后用相應(yīng)的二抗孵育，進(jìn)行免疫熒光檢查。
　　 5、檢測相關(guān)毒性基因的表達(dá)。IFN-γ處理野生株HP26695和Hp1125突變株后，通過WesternBlot檢測了CagA和NapA的表達(dá)變化;然后分別檢測了在8h點(diǎn)時，相關(guān)基因RN

10、A水平上的變化，包括毒性相關(guān)的基因:cagA、vacA、napA、ureA和ureB;蛋白降解相關(guān)基因:clpX、clpP;細(xì)菌粘附相關(guān)基因:babA。
　　 結(jié)果
　　 1、用IFN-γ體外刺激H.pylori野生株后，和對照相比，其spoT的表達(dá)逐漸升高，在8h時差異最為顯著，說明IFN-γ可以引起H.pylori的嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答反應(yīng)。
　　 2、生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)，H.pylori的膜蛋白Hp1125與oprF

11、具有較高的同源性。
　　 3、在HP26695上成功構(gòu)建了Hp1125的突變株。
　　 4、用IFN-γ刺激Hp1125突變株發(fā)現(xiàn)spoT基因的表達(dá)與未用IFN-γ刺激時相似，沒有顯著的變化。提取的膜蛋白進(jìn)行Westen-blot檢查發(fā)現(xiàn)，IFN-γ只在野生株的蛋白泳道中有條帶，敲除Hp1125的膜蛋白中未見有條帶。
　　 5、用WesternBlot檢測IFN-γ刺激和未刺激HP26695和Hp1125突變株中

12、不同時間點(diǎn)的CagA和NapA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在用IFN-γ刺激野生株8h時，CagA和NapA表達(dá)均下降;而同樣的處理在Hp1125突變株中未見到明顯的變化。RNA水平上的檢測同樣證實了這一點(diǎn)。幽門螺桿菌其它毒力基因vacA、ureA、ureB、clpX、clpp和babA等在Hp1125突變株中mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，暗示Hp1125的突變對H.pylori的致病、粘附都有要的影響。
　　 結(jié)論
　　 IFN-γ刺激H.

13、pylori野生株時，spoT基因高表達(dá)，其毒性相關(guān)基因表達(dá)降低。當(dāng)Hp1125不表達(dá)時，IFN-γ刺激后其spoT的表達(dá)與野生株中無差異，此時相關(guān)的毒性基因表達(dá)升高。結(jié)合我們之前的結(jié)果，spoT表達(dá)高時，毒性相關(guān)基因表達(dá)顯著低于△spoT突變株。我們可以推測H.pylori可以通過Hp1125這個外膜蛋白識別并結(jié)合環(huán)境中IFN-γ-，激活自身嚴(yán)謹(jǐn)應(yīng)答反應(yīng)調(diào)控基因spoT，進(jìn)而調(diào)節(jié)自身相關(guān)分子的表達(dá)，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化，達(dá)到逃避清除的