沙門(mén)菌屬外膜蛋白免疫機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 研究沙門(mén)菌屬外膜蛋白(OuterMembraneProtein，OMP)激化巨噬細(xì)胞的作用及對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)作用。 方法： 利用十二烷基肌氨酸鈉法提取傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphi)、甲型付傷寒沙門(mén)菌(SalmonellaparatyphiA)、鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphimurium)、腸炎沙門(mén)菌(Salmonella鯽teritidis)外膜蛋白，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(S

2、DS-PAGE)分析所提取的外膜蛋白的組分。沖洗小鼠腹腔，利用巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特性獲得小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；傷寒沙門(mén)菌外膜蛋白和傷寒沙門(mén)菌分別與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞相互作用，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(2h、12h、24h、36h、48h)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1α、TNF-α、IL-12的變化；預(yù)先用OMP刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，體外觀(guān)察比較巨噬細(xì)胞內(nèi)沙門(mén)菌存活數(shù)量。用鼠傷寒沙門(mén)菌OMP與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑制成乳油狀，按照免疫程序多次多部位

3、免疫新西蘭兔，獲得抗OMP抗體血清；以酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定兔抗鼠傷寒沙門(mén)菌OMP抗體血清的效價(jià)；抗體血清以35％飽和硫酸銨溶液沉淀，以pH7.4的lOmMPBS透析純化；蛋白免疫印跡法(Western-B10t)分析兔抗鼠傷寒沙門(mén)菌OMP抗體與傷寒沙門(mén)菌(5)~7monellatyphi)、甲型付傷寒沙門(mén)菌(SalmonellaparatyphiA)、鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphimurium)OMP抗原的反應(yīng)特異性。采用R

4、eed和Muench方法計(jì)算小鼠對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的半數(shù)致死量(LD50)。小鼠經(jīng)鼠傷寒沙門(mén)菌OMP免疫后，分別用100LD50、500LD50、1000LD50鼠傷寒沙門(mén)菌攻擊小鼠，觀(guān)察小鼠的存活率，分析鼠傷寒沙門(mén)菌OMP誘導(dǎo)小鼠的主動(dòng)免疫保護(hù)；小鼠經(jīng)兔抗鼠傷寒沙門(mén)菌OMP抗血清免疫后，分別用50LD50、100LD50鼠傷寒沙門(mén)菌攻擊小鼠，觀(guān)察小鼠的存活率，分析鼠傷寒沙門(mén)菌OMP誘導(dǎo)小鼠的被動(dòng)免疫保護(hù)；小鼠經(jīng)鼠傷寒沙門(mén)菌OMP免疫后，后

5、足摯注射鼠傷寒沙門(mén)菌，觀(guān)察小鼠足墊腫脹變化，分析鼠傷寒沙門(mén)菌OMP誘導(dǎo)小鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)情況。 結(jié)果： 1、傷寒沙門(mén)菌菌株、甲型付傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌外膜蛋白都具有多種組成成分，經(jīng)SDS-PAGE分析，具有分子量大約為23KD、33KD、41KD、53KD的多條條帶。 2、蛋白免疫印跡法(Western-Blot)分析顯示兔抗鼠傷寒沙門(mén)菌OMP抗體與傷寒沙門(mén)菌、甲型付傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌OM

6、P抗原在分子量大約為23KD具有共同的顯色條帶。 3、傷寒沙門(mén)菌OMP誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-1α、TNF-α、IL-12的分泌，并隨時(shí)間而變化：IL-1α在36h達(dá)到分泌高峰，TNF-α在12h達(dá)到分泌高峰，IL-12在選定的最遲監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)(48h)仍呈上升狀態(tài)；這與傷寒沙門(mén)菌刺激巨噬細(xì)胞后IL-1α、TNF-α、IL-12的變化有區(qū)別：IL-1α、TNF-α峰濃度有差異(p＜0．05)，IL-12達(dá)到峰濃度時(shí)間不同；傷寒沙門(mén)菌OM

7、P與巨噬細(xì)胞作用后減少巨噬細(xì)胞內(nèi)存活菌的數(shù)量(p＜0．05)。 4、采用鼠傷寒沙門(mén)菌免疫新西蘭兔可以獲得效價(jià)為1：2048的兔抗鼠傷寒沙門(mén)菌OMP抗體血清。 5、按照Reed和Muench方法，小鼠對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌的半數(shù)致死量(LD50)為1．56×104CFU。 6、小鼠經(jīng)鼠傷寒沙門(mén)菌OMP免疫后，能100％保護(hù)iOOLD50、500LD50的鼠傷寒沙門(mén)菌的攻擊，甚至對(duì)1000LD50的鼠傷寒沙門(mén)菌的攻擊的存活率

8、也有83％(5／6)。 7、小鼠經(jīng)抗鼠傷寒沙門(mén)菌OMP抗血清免疫后，能l00％保護(hù)50LD50、1OOLD50(最大試驗(yàn)菌落數(shù))的鼠傷寒沙門(mén)菌的攻擊。 8、小鼠經(jīng)鼠傷寒沙門(mén)菌OMP免疫后，后足墊注射鼠傷寒沙門(mén)菌，24h足墊腫脹程度與對(duì)照組比較p＜0．001，兩組具有明顯差異。 結(jié)論： 沙門(mén)菌屬外膜蛋白具有能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，并激活巨噬細(xì)胞殺滅沙門(mén)菌的特性；通過(guò)動(dòng)物接種可使被接種動(dòng)物抵抗沙門(mén)菌的攻擊