擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU基因的克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)是危害水產(chǎn)動(dòng)物的重要病原菌之一，不僅可引起魚蟹類嚴(yán)重的腹水病，而且還可通過水產(chǎn)動(dòng)物和水產(chǎn)品感染人類，引起腹瀉和食物中毒。腹水病是我省魚蟹類養(yǎng)殖中常見的疫病之一，控制腹水病的發(fā)生和蔓延已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。細(xì)菌外膜蛋白黏附素黏附定植于宿主組織細(xì)胞表面是細(xì)菌感染的重要初始環(huán)節(jié)，否則細(xì)菌就不能在局部定居，繼而產(chǎn)生毒素或侵入深部組織，引起感染發(fā)生。研制以抗黏附作用為主的外膜蛋白疫苗已成為免疫防治

2、細(xì)菌感染最有效的措施之一。為此，本課題以擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU為靶蛋白，在對(duì)ompU克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上研究融合重組蛋白的抗原性和免疫保護(hù)性，旨在為研制OmpU基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。 首先，對(duì)擬態(tài)弧菌安徽分離株進(jìn)行ompU PCR擴(kuò)增、克隆測序和生物信息學(xué)分析。研究中根據(jù)霍亂弧菌參考株ompU全序列，設(shè)計(jì)合成2對(duì)分別針對(duì)ompU部分序列和全序列的特異性引物，以擬態(tài)弧菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ompU，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18

3、-T-OmpU，篩選陽性重組克隆進(jìn)行序列測定和生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：4株擬態(tài)弧菌安徽分離株均攜帶ompU，ompU片段長為849bp，該基因片段的核苷酸同源性在擬態(tài)弧菌安徽分離株之間以及與霍亂弧菌參考株之間均較高，分別介于94.2％～100％和83.4％～87.6％之間。擬態(tài)弧菌HX4菌株ompU ORF長1 03 8 bp，編碼346個(gè)氨基酸，OmpU相對(duì)分子量為36.95kDa，其N端前22個(gè)氨基酸組成信號(hào)肽，N末端氨基酸序列與

4、流感嗜血桿菌HMW黏附素序列具有相似性，在5aa～21aa和201aa～218aa之間有兩個(gè)明顯跨膜域，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主，間或有β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，DNAstar軟件預(yù)測出在OmpU的20aa-34aa、36aa-67aa、73aa-81aa、88aa-112aa、123aa-134aa、143aa-160aa、164aa-174aa、177aa-200aa、217aa-227aa、244aa-259aa、275aa-2

5、88aa、295aa-303aa和314aa-340aa之間存在抗原表位。表明擬態(tài)弧菌OmpU是一種具有較好保守性和抗原性的黏附素孔蛋白。 其次，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-OmpU并進(jìn)行原核表達(dá)。研究中重新設(shè)計(jì)l對(duì)包含．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增ompU全序列，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-OmpU并轉(zhuǎn)化至Ecoli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)、產(chǎn)物鑒定和可溶性分析。結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒

6、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，能在E. coli BL21中表達(dá)分子量約為62.9 kDa的融合蛋白GST-OmpU。表明ompU得到了良好的融合表達(dá)。 最后，采用免疫印跡和免疫保護(hù)性試驗(yàn)測定融合蛋白GST-OmpU的抗原性和免疫保護(hù)性。研究中將純化的Omps、GST-OmpU以及誘導(dǎo)表達(dá)菌裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜進(jìn)行Western blot檢測。同時(shí)以融合蛋白GST-OmpU免疫接種實(shí)驗(yàn)小鼠，四次免疫后進(jìn)行免

7、疫保護(hù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示GST-OmpU和Omps誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫血清可以相互識(shí)別GST-OmpU和Omps，GST-OmpU保留了Omps的某些抗原性，免疫小鼠可部分抵抗50LD<,50>擬態(tài)弧菌的攻擊，免疫保護(hù)率為60％。表明OmpU是擬態(tài)弧菌的保護(hù)性抗原之一。綜上所述，本研究從分子水平揭示了ompU在擬態(tài)弧菌安徽分離株間以及霍亂弧菌參考株間具有高度同源性，OmpU是一種具有較好抗原性和保守性的黏附素孔蛋白。成功構(gòu)建了pGEX-4T