霍亂弧菌tcpA基因的克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)作用研究.pdf

1、霍亂弧菌（Vibrio cholerae，VC）是水產(chǎn)動(dòng)物中常見的、危害最大的病原菌之一，不僅可引起魚類嚴(yán)重的脫黏病和細(xì)菌性腸炎，而且還可通過水產(chǎn)品感染人類，引起人類烈性腸道傳染病。目前控制該病的主要手段是使用抗菌藥物，但是由于該菌感染的普遍性、耐藥菌株的不斷增加，在很大程度上限制了抗菌藥物的療效。因此，該病免疫防治的研究具有重要意義。鑒于霍亂弧菌通過毒素共調(diào)菌毛（toxin-coregulated pilus，Tcp）黏附定植于小腸黏

2、膜是其致病的前提，阻斷霍亂弧菌的黏附定植即可防止感染的發(fā)生。對(duì)此，本研究選擇暴露于細(xì)菌表面并與霍亂弧菌黏附定植密切相關(guān)的黏附素TcpA為目標(biāo)，通過基因工程技術(shù)獲得重組蛋白GST-TcpA，研究其免疫保護(hù)作用，以確定重組TcpA蛋白在霍亂弧菌基因工程亞單位疫苗研制中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 首先，應(yīng)用PCR方法從霍亂弧菌Y1菌株基因組DNA中擴(kuò)增tcpA結(jié)構(gòu)基因并克隆至pMD18-T載體進(jìn)行序列測(cè)定與分析。序列分析顯示tcpA結(jié)構(gòu)基因由

3、675個(gè)核苷酸組成，開放閱讀框完整無中斷，編碼由224個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子量約為21 kD的TcpA蛋白。tcpA結(jié)構(gòu)基因在霍亂弧菌Y1菌株與Genbank中登錄的20個(gè)霍亂弧菌參考株之間均具有較高的同源性，彼此間的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別介于71.8％-99.7％和57.7％-99.3％之間。這些研究結(jié)果為tcpA基因的亞克隆和表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
　　 其次，將tcpA基因亞克隆至表達(dá)載體pGEX-4T-1并在大

4、腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)。根據(jù)pGEX-4T-1表達(dá)載體閱讀框的要求，設(shè)計(jì)1對(duì)包含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物，以重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-tcpA為模板，擴(kuò)增tcpA結(jié)構(gòu)基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后，亞克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-1中，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）。pGEX-4T-1-tcpA/BL21重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可以包涵體形式高效表達(dá)分子量約47.0 kD的重組蛋白GST-Tc

5、pA，并經(jīng)提純后獲得大量的該重組蛋白，從而為進(jìn)一步研究其免疫保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 最后，分別采用Western blot、細(xì)胞黏附抑制試驗(yàn)和免疫保護(hù)性試驗(yàn)測(cè)定重組蛋白GST-TcpA的抗原性和體內(nèi)外免疫保護(hù)作用。pGEX-4T-1-tcpA/BL21重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以霍亂弧菌菌毛蛋白抗血清為一抗進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果顯示重組蛋白GST-TcpA可與菌毛蛋白抗血

6、清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，證實(shí)重組TcpA蛋白保持了天然Tcp蛋白的抗原性。以霍亂弧菌菌體、霍亂弧菌菌毛蛋白、重組蛋白GST-TcpA和GST蛋白分別免疫小鼠制備抗血清，檢測(cè)這四種抗血清在細(xì)胞黏附抑制試驗(yàn)中的作用。結(jié)果顯示菌體抗血清可完全抑制細(xì)菌對(duì)HEp-2細(xì)胞的黏附，菌毛抗血清和重組蛋白抗血清可明顯降低細(xì)菌對(duì)HEp-2細(xì)胞的黏附，而GST抗血清無黏附抑制作用。表明重組蛋白抗血清在體外能明顯抑制霍亂弧菌Y1菌株對(duì)HEp-2細(xì)胞的黏附作用，除

7、Tcp外，霍亂弧菌Y1菌株尚表達(dá)其它黏附素。實(shí)驗(yàn)小鼠分別經(jīng)純化重組蛋白GST-TcpA和GST蛋白四次免疫后，用Y1株菌液進(jìn)行攻擊，結(jié)果顯示重組蛋白免疫組小鼠的免疫保護(hù)率為81.25％，而GST免疫組小鼠和生理鹽水對(duì)照組小鼠全部死亡。說明重組TcpA蛋白對(duì)霍亂弧菌感染具有較好的免疫保護(hù)作用。
　　 綜上所述，本研究在成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-tcpA并獲得重組蛋白GST-TcpA的基礎(chǔ)上，探明了重組TcpA蛋白仍保