霍亂弧菌Fosmid文庫的構建、分析及應用.pdf

1、霍亂，又稱為亞細亞霍亂或傳染性霍亂，是主要由O1和O139血清型霍亂弧菌引起的一種烈性、猝發(fā)性的細菌性傳染病，其危害僅次于鼠疫。隨著環(huán)境和人類生活方式的轉變，霍亂弧菌已經(jīng)出現(xiàn)了細菌毒力、菌落特征等方面的變異。而隨著分子生物學的發(fā)展，霍亂弧菌的檢測方法也從傳統(tǒng)的表型特征鑒定向遺傳特征基因鑒定轉變。為了能夠準確、快速、安全的檢測霍亂弧菌，特別是產(chǎn)毒型霍亂弧菌，本研究首先從分子生物學水平構建了包含霍亂弧菌全套基因的Fosmid文庫，使霍亂弧菌

2、遺傳信息轉移到易于培養(yǎng)的大腸桿菌中去；通過基因水平的篩選，獲得了霍亂弧菌常見的5種高度保守特征基因。為了滿足普通實驗室對霍亂弧菌陽性對照的需求，本論文對篩選出的5種霍亂弧菌保守基因的Fosmid質粒進行穩(wěn)定性研究，制備出可作為陽性對照的霍亂弧菌Fosmid質粒標準樣品并以制備的tcpA-Fosmid質粒標準樣品為模板，通過對傳統(tǒng)切刻內切恒溫擴增技術（NEMA）的優(yōu)化和改良，建立一種新型的O1和O139型霍亂弧菌的切刻內切恒溫擴增（NEM

3、A）快速檢測方法。
　　1.選取O1和O139型霍亂弧菌為研究對象，利用低熔點瓊脂糖包埋法獲得高質量的O1和O139型霍亂弧菌基因組DNA，用隨機剪切法將基因組進行片段化處理，脈沖電泳分離片段化DNA并切膠回收33kb~48kb之間的DNA片段，然后對DNA片段進行末端平滑化和磷酸化處理，與pCC1FOS載體連接，經(jīng)包裝、轉染、篩選陽性克隆構建霍亂弧菌Fosmid文庫。所建的Fosmid文庫庫容量為355Mb，平均插入片段為35k

4、b，共保存9600個克隆，空載率小于2％。經(jīng)穩(wěn)定性實驗證明所建文庫克隆能夠穩(wěn)定繁殖。為下一步O1和O139型霍亂弧菌目的基因的篩選、文庫的應用研究奠定了基礎。
　　2.利用實時熒光PCR從霍亂弧菌Fosmid文庫中篩選出含tcpA、ctxAB、hlyA、rfb-O1和rfb-O139保守性特征基因的陽性克隆菌株，通過提取Fosmid質粒并對其穩(wěn)定性進行研究，最終研制出具有較好穩(wěn)定性的含有霍亂弧菌tcpA基因、hlyA基因、rfb-

5、O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因的Fosmid質粒標準樣品。該質粒標準品的研制基本滿足了實驗室對霍亂弧菌陽性對照的需求。
　　3.選取已制備的tcpA-Fosmd質粒標準樣品為陽性模板，對傳統(tǒng)NEMA技術進行了優(yōu)化和改良。在參考傳統(tǒng)的NEMA反應體系基礎上，對影響擴增效率的關鍵因素—如溫度、緩沖環(huán)境、鎂離子及DMSO濃度分別進行了優(yōu)化。經(jīng)試驗確定，以磷酸鉀緩沖液作為緩沖環(huán)境，反應溫度59℃、鎂離子和DMSO終濃度分別