霍亂弧菌O139的LPS0CTB結合疫苗的研究.pdf

1、霍亂是一種烈性腸道傳染病，是由革蘭氏陰性霍亂弧菌引起的嚴重水樣腹瀉疾病。人類是霍亂弧菌的天然宿主，通過食入被霍亂弧菌污染的水或食物而感染。其感染的特點是嚴重腹瀉和嘔吐，由于水和電解質的流失導致在數(shù)小時內(nèi)造成血容量減少性休克，代謝性酸中毒和鉀的缺乏。并發(fā)癥包括腎衰竭、動脈閉塞、肺水腫、孕婦流產(chǎn)和兒童癲癇?；魜y的流行特點是爆發(fā)式，歷史上曾經(jīng)爆發(fā)過7次世界大流行，開始在數(shù)個不同地點同時發(fā)生，然后迅速傳播流行可累及許多國家并持續(xù)多年，尤其在非洲

2、、亞洲和拉丁美洲等一些發(fā)展中國家較為嚴重。而控制它的有效途徑之一就是免疫預防接種，因此尋求研制一種安全有效適用于各種人群的霍亂疫苗極其重要。
　　 已證實霍亂弧菌細胞壁上的脂多糖(LPS)既是毒力因子又是重要的保護性抗原，能誘導機體產(chǎn)生殺弧菌抗體。但是LPS分子量較小，免疫原性弱，且再次免疫后不能產(chǎn)生免疫加強效應。并且多糖類抗原不能誘導嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生具保護水平的抗體，但此年齡組又是細菌性傳染病發(fā)病的高危人群?；魜y毒素B亞單位(C

3、TB)是霍亂毒素無毒的部分，具有良好的免疫原性，能產(chǎn)生重要的抗毒抗體。并且已經(jīng)證實CTB是一種很好的粘膜佐劑，能夠誘導機體產(chǎn)生粘膜免疫反應。
　　 本研究將CTB作為載體蛋白與LPS共價結合制備成結合疫苗，給多糖成分賦予“載體效應”，既能增強LPS的免疫原性，使其由T細胞非依賴抗原成為T細胞依賴抗原，又使誘導的免疫反應具有免疫記憶和加強效應，產(chǎn)生大量的殺菌抗體；而CTB本身又能產(chǎn)生高效價的抗毒抗體，這正是抗霍亂疫苗應該包括的兩個

4、方面。目的是制備一種安全有效的能針對各種人群的口服霍亂疫苗。
　　 本研究首先采用熱酚水法從霍亂弧菌O139中提取純化LPS，最終獲得純度良好的LPS干粉。然后用1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)將提取的LPS活化后與載體蛋白CTB共價偶聯(lián)，產(chǎn)物經(jīng)過Superdex200凝膠過濾層析柱進行純化，最終制備成高純度的LPS-CTB共價結合物。用制備的LPS-CTB結合物免疫小鼠，取小鼠血清和糞便進行ELISA檢測。采用給

5、以鹽水的小鼠做陰性對照，同時進行單獨給LPS、單獨給CTB以及給rBS-WC疫苗的對照實驗。實驗結果證明，本研究制備的LPS-CTB結合物不僅能有效誘導小鼠機體產(chǎn)生血清抗LPS和抗CTB的IgG和IgA抗體，其中，抗LPS的IgG和IgA的抗體滴度分別達到1:970和1:1690，抗CTB的IgG和IgA抗體滴度更是高達1:163840。并且該結合物能很好的誘導小鼠的腸粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對霍亂免疫極為重要的分泌型IgA抗體。另外在多次免疫