霍亂弧菌與自由生活阿米巴原蟲共生的研究.pdf

1、自1817年以來(lái)，霍亂弧菌已引起7次霍亂世界大流行，迄今尚未得到有效控制，仍然是全球性的重要衛(wèi)生問(wèn)題之一。雖然近年來(lái)對(duì)于霍亂弧菌的生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但關(guān)于該菌在霍亂疫區(qū)季節(jié)性流行、流行間歇期的生存問(wèn)題以及越冬機(jī)制依舊困擾著微生物學(xué)者。自由生活阿米巴原蟲(free-livingamoebae，F(xiàn)LA)廣泛分布于自然界中，它作為一些重要的致病菌如軍團(tuán)菌、分枝桿菌和副衣原體等的儲(chǔ)存宿主和傳播媒介越來(lái)越受到人們的重視。FLA原蟲，

2、尤其是其包囊，能抵抗不利的溫度、pH、殺蟲劑、化學(xué)藥品以及消毒劑的作用，同時(shí)也對(duì)其胞內(nèi)菌在抵抗不利的物理和生化環(huán)境時(shí)起到重要的保護(hù)作用。FLA原蟲是霍亂弧菌復(fù)雜的水生態(tài)環(huán)境中的重要成員。為此，本課題通過(guò)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察FLA原蟲與霍亂弧菌之間的相互關(guān)系，探討FLA原蟲在不同溫度以及消毒劑作用下對(duì)霍亂弧菌存活的影響，可為闡明自由生活阿米巴原蟲對(duì)霍亂弧菌在外環(huán)境中生存的影響以及霍亂的防治提供新的思路、策略和理論依據(jù)。
　　28℃實(shí)驗(yàn)環(huán)境

3、下以埃爾托型霍亂弧菌、古典型霍亂弧菌以及非O1群霍亂弧菌分別感染多噬棘阿米巴原蟲。Gimenez染色結(jié)果顯示，共培養(yǎng)8hr后霍亂弧菌進(jìn)入棘阿米巴原蟲滋養(yǎng)體體內(nèi)。共培養(yǎng)24hr，霍亂弧菌在棘阿米巴滋養(yǎng)體體內(nèi)增多。電鏡下，霍亂弧菌主要存在于棘阿米巴滋養(yǎng)體吞噬體空泡內(nèi)，隨著滋養(yǎng)體包囊化，霍亂弧菌主要分布于包囊胞漿吞噬空泡內(nèi)、雙層細(xì)胞壁之間以及胞膜周圍。此外，還可在棘阿米巴內(nèi)側(cè)細(xì)胞壁與胞膜之間觀察到古典型霍亂弧菌。在棘阿米巴滋養(yǎng)體吞噬空泡內(nèi)可觀

4、察到處于二分裂形態(tài)的霍亂弧菌，提示霍亂弧菌能在棘阿米巴滋養(yǎng)體內(nèi)進(jìn)行分裂繁殖。包囊傳代實(shí)驗(yàn)表明，霍亂弧菌能在包囊在分化成滋養(yǎng)體的過(guò)程中釋放出胞外。因此，阿米巴原蟲滋養(yǎng)體可成為霍亂弧菌增殖的孵化器，而阿米巴原蟲包囊為霍亂弧菌環(huán)境生存提供了條件。
　　在4℃水環(huán)境中，與棘阿米巴原蟲共培養(yǎng)的埃爾托霍亂弧菌的活菌數(shù)在30d內(nèi)由感染前的(3.32±0.43)×109cfu/ml降低為<1cfu/ml，而對(duì)照組到45d時(shí)才下降到<1cfu/ml

5、。但與埃爾托霍亂弧菌共培養(yǎng)50d的棘阿米巴包囊可經(jīng)包囊傳代再檢測(cè)出埃爾托霍亂弧菌。在28℃條件下，棘阿米巴的存在可使埃爾托霍亂弧菌在水環(huán)境中維持較高的濃度。隔離試驗(yàn)結(jié)果表明，棘阿米巴原蟲分泌或代謝所產(chǎn)生的物質(zhì)可能有利于霍亂弧菌的生存。棘阿米巴包囊提高了埃爾托霍亂弧菌在低溫水環(huán)境中的生存能力，但模擬環(huán)境下尚不足以保護(hù)其在低溫下長(zhǎng)期生存。
　　為確定環(huán)境中霍亂弧菌與FLA原蟲兩者之間的關(guān)系，我們?cè)邳S浦江水域中分離得到一株非O1群(非O

6、139群)霍亂弧菌，并在同一水域的河水和河岸土壤中各分離到的1株自由生活阿米巴原蟲。以自由生活阿米巴18SrRNA通用引物PCR檢測(cè)陽(yáng)性，特異性引物檢測(cè)結(jié)果顯示均為棘阿米巴屬。將序列在CloneManager軟件中與參照序列進(jìn)行多重比對(duì)，分離自黃浦江水域的棘阿米巴W-HPR和E-HPR的基因型均為T4型。將分離自同一水域的非O1群霍亂弧菌分離株與W-HPR棘阿米巴在28℃共培養(yǎng)8h后，非O1群霍亂弧菌進(jìn)入棘阿米巴原蟲滋養(yǎng)體體內(nèi)。隨著共培

7、養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，霍亂弧菌在W-HPR滋養(yǎng)體體內(nèi)逐漸增多。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接反映出黃浦江水域中非O1群霍亂弧菌分離株與棘阿米巴原蟲之間可存在共生關(guān)系。
　　為探討消毒劑對(duì)棘阿米巴原蟲及其胞內(nèi)霍亂弧菌的殺滅作用，采用不同濃度有效氯含量的漂粉精進(jìn)行消毒試驗(yàn)。漂粉精消毒模擬水樣作用30min能殺滅棘阿米巴滋養(yǎng)體和包囊的最低有效劑量分別為50mg/L和125mg/L。8份上海居民飲用水中的4份水樣經(jīng)NNA平板培養(yǎng)可觀察到FLA原蟲。含有效氯

8、濃度為2mg/L的漂粉精消毒劑在殺滅埃爾托霍亂弧菌時(shí)，棘阿米巴原蟲能對(duì)埃爾托霍亂弧菌在抵抗消毒劑作用時(shí)起到一定的保護(hù)作用。
　　綜上可見，霍亂弧菌在適應(yīng)棘阿米巴原蟲環(huán)境后，能利用原蟲所提供的養(yǎng)料進(jìn)行分裂、增殖、生長(zhǎng)，兩者屬于共生關(guān)系。在常溫下，棘阿米巴的存在可使埃爾托霍亂弧菌在水環(huán)境中維持較高的濃度；而在低溫水環(huán)境中，雖然棘阿米巴包囊能提高埃亂弧菌的生存能力，但模擬環(huán)境下尚不足以保護(hù)其在低溫下長(zhǎng)期生存。同時(shí)，棘阿米巴原蟲能對(duì)埃爾托