膽汁酸分子與霍亂弧菌DsbA蛋白相互作用機制的研究.pdf

1、霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌，是人類傳染病霍亂的病原體，可引起感染者劇烈嘔吐，腹瀉，大量失水，甚至死亡?；魜y弧菌在宿主體內，只有進入腸道并定殖于小腸上皮細胞后，其致病性相關毒素基因tcp和ct才會被大量表達。通過對小腸提取物分離純化分析發(fā)現(xiàn)，腸道中的膽汁酸分子通過霍亂弧菌的DsbA蛋白使毒素基因調控蛋白TcpP形成更多具有功能的二聚體結構，從而誘導產(chǎn)生大量的毒素因子。敲除DsbA的編碼基因vcdsbA后，毒素基因的表達就不再受膽汁酸分子的誘導

2、，而且TcpP不能形成二聚體。因此，推測當霍亂弧菌進入人體腸道后，首先利用膽汁酸分子與DsbA的相互作用調控下游毒素基因網(wǎng)絡，從而產(chǎn)生大量的毒素因子。
　　為研究膽汁酸分子與DsbA的相互作用，首先將霍亂弧菌的DsbA蛋白編碼基因vc0034(vcdsbA)克隆至原核表達載體pET28a，轉化E.coli Rosetta進行蛋白表達，并使用鎳離子樹脂純化，得到霍亂弧菌DsbA蛋白。然后利用等溫滴定量熱(ITC)試驗檢測膽汁酸分子T

3、C與DsbA的互作情況。結果表明，TC與DsbA互作的平衡解離常數(shù)KD為0.93×10-4M，化學計量比n為1.17 Sites，焓變化ΔH為-3647 cal/mol，熵變化ΔS為6.22 cal/mol，二者反應熱量變化很大且親和力很強，說明DsbA與TC確實存在相互作用。為了進一步研究DsbA的生物學功能，進行了胰島素還原酶試驗，發(fā)現(xiàn)DsbA還原酶活性受TC抑制。
　　為了進一步確定DsbA與膽汁酸分子互作的關鍵氨基酸位點，

4、利用易錯PCR的方法構建了突變文庫，并通過檢測含有pBBRLux熒光報告質粒的菌株的熒光表達冷光值的方法進行文庫篩選，對突變的vcdsbA基因進行序列測定。最終，從近一萬個突變株中篩選到dsbAH113L，dsbAD135V，dsbAE188A三個對TC不敏感的疑似株。為了進一步研究這三個位點的作用，在大腸桿菌中表達了DsbAH113L，DsbAD135V，DsbAE188A三個蛋白。結果發(fā)現(xiàn)它們在大腸桿菌dsbA缺失株中對TC較不敏感