TRAF6蛋白相互作用蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、由骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)和細(xì)胞核因子κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)組成的OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是骨代謝調(diào)節(jié)方面研究熱門的系統(tǒng)。TRAF6是NF-κB受體活化因子（RANK）的重要的銜接分子，RANK通過(guò)TRAF6活化下游的信號(hào)因子引

2、起破骨細(xì)胞的分化、增殖。
　　為了更加深入探究TRAF6蛋白在宿主細(xì)胞中的功能，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，篩選和尋找與TRAF6相互作用的蛋白，并以此蛋白建立新的研究方向。首先構(gòu)建pGBKT7-TRAF6重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109，檢測(cè)其自激活性，然后在含有pGBKT7-TRAF6重組質(zhì)粒的酵母菌株中轉(zhuǎn)入人B淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)，進(jìn)行2輪篩選，并α-gal檢測(cè)，再回復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)排除假陽(yáng)性。篩選結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLA

3、ST比對(duì)，最終得到能夠在酵母雙雜交系統(tǒng)中與TRAF6相互作用的蛋白11個(gè)，其中包括已經(jīng)發(fā)表的TFG蛋白。
　　經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索和分析，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將BCL3蛋白與TRAF6蛋白的相互作用作為研究方向，構(gòu)建含有TRAF6、BCL3基因片段及特異性標(biāo)簽的兩個(gè)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-His-TRAF6、pCMV-3FLAG-BCL3-EGFP，并將它們共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。運(yùn)用免疫共沉淀的方法證明TRAF6和BCL3可以在人細(xì)