兔出血癥病毒VP60蛋白與膜突蛋白相互作用的鑒定.pdf

1、兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic diseasevirus,RHDV)引起的危害3月齡以上青年兔和成年兔的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。該病于1984年在中國首次報道后,在世界各地相繼發(fā)生。迄今,RHD已成為兔的一種毀滅性傳染病,給養(yǎng)兔業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 從1984年RHD首次報道至今,關(guān)于RHDV的研究已經(jīng)取得了很大的

2、發(fā)展,但國內(nèi)外的研究學(xué)者至今仍未發(fā)現(xiàn)一株能進行RHDV穩(wěn)定繁殖的細胞系,故而就缺少一個可以從分子水平研究病毒的技術(shù)平臺,這嚴重阻滯了對RHDV的研究,因此,RHDV致病的分子機理至今仍不十分清楚。在RHD的發(fā)生發(fā)展過程中,肝臟是病毒增殖的主要器官。臨床病理解剖中肝臟的病理變化最為嚴重,并且在RHDV大量制備純化的方案中,病死兔的肝臟往往是病毒的重要來源,研究者直接取肝臟勻漿后提取病毒,所以從肝臟細胞出發(fā),尋找與RHDV相互作用的細胞表面

3、蛋白具有重要意義,現(xiàn)已有研究證實RHDV可感染原代兔肝臟細胞。VP60是RHDV的主要衣殼蛋白,研究表明VP60蛋白與RHDV的致病性和免疫原性有著密切關(guān)系,故研究能與VP60蛋白相互作用的兔肝細胞表面蛋白,對了解RHDV致病的分子機制以及RHD的防控具有重要意義。
　　 本研究擬采用SMART技術(shù),將兔肝臟cDNA定向克隆到pEXP-Lib載體中,構(gòu)建兔肝臟細胞的真核表達文庫。采用表達克隆法篩選文庫,以純化的VP60為誘餌蛋白

4、,從真核表達文庫中篩選能與VP60蛋白發(fā)生相互作用的蛋白。通過免疫共沉淀試驗、血凝抑制試驗,體外驗證蛋白之間的相互作用；借助激光共聚焦試驗技術(shù)證明蛋白在細胞內(nèi)的共定位。實驗結(jié)果表明,兔肝臟細胞真核表達文庫的鑒定結(jié)果顯示插入片段分布在0.3 kb～2.0kb之間,重組率約為86％,表明獲得了高質(zhì)量的兔肝臟細胞真核表達文庫。篩選結(jié)果顯示有26個EST片段與兔功能基因有較高的同源性,序列分析以及對蛋白的功能性分析,膜突蛋白(Moesin)可與

5、VP60發(fā)生相互作用,敵對Moesin進行進一步的相互作用驗證以及功能性研究。以兔肝臟cDNA為模板,擴增Moesin部分片段基因688nt～2157nt,分別連接到載體pET-30a和pEGFP-N1上,構(gòu)建Moesin的原核表達載體pET-30a-Msn和真核表達載體pEGFP-N1-Msn。將pET-30a-Msn重組表達載體轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞,誘導(dǎo)表達并純化獲得可溶性Moesin蛋白,通過免疫共沉淀試驗和血凝抑制試驗驗證

6、Moesin與VP60的相互作用。同時,將pEGFP-N1-Msn與pcDNA3.1-VP60重組表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,采用激光共聚焦試驗技術(shù)對Moesin與VP60在細胞內(nèi)的共定位進行分析,證明了Moesin與VP60在哺乳動物細胞內(nèi)能夠通過相互作用達到共定位。
　　 本研究通過表達克隆法從兔肝細胞真核表達文庫中篩選到Moesin基因,并在體外成功表達了Moesin部分片段基因,證明了其與RHDV VP60蛋白之間