鴨瘟病毒UL1與gH蛋白相互作用的初探.pdf

1、1、鴨瘟病毒UL1基因的生物信息學(xué)分析
　　對(duì)DPV UL1基因的核酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:DPV UL1基因編碼的蛋白由236aa組成，分子量約為26221.08Da，等電點(diǎn)為8.480，其中Val、Gly、Arg的含量最高，分別為9.8％、8.5％、8.1％。對(duì)其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，表明DPV更接近α皰疹病毒亞科的Simplexvirus屬。DPV UL1基因編碼蛋白有信號(hào)肽

2、、無(wú)跨膜區(qū)，其抗原表位主要集中在27-33、63-64、87-106、151-153、155-157、167-196、204-210、214-236aa。預(yù)測(cè)DPV UL1編碼蛋白可能含有5個(gè)O-糖基化位點(diǎn)、7個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、2個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位分析表明，DPV UL1基因編碼蛋白存在于細(xì)胞核、細(xì)胞漿及線粒體中的可能性分別為4.3％、17.4％和47.8％。
　　2、鴨瘟病毒UL1基因的原核表達(dá)、蛋白純化及多抗

3、制備
　　由于DPV UL1的全基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中無(wú)法表達(dá)，所以根據(jù)生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增UL1基因上除去信號(hào)肽部分但包含了主要抗原表位的區(qū)域，共計(jì)468個(gè)堿基?？寺〉絧MD19-T中，經(jīng)雙酶切后，再定向插入到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，最終構(gòu)建了pET32a(+)-gLt（UL1截段基因）重組質(zhì)粒。接下來(lái)分別對(duì)原核表達(dá)宿主菌、IPTG濃度以及誘導(dǎo)溫度等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得pET32a(+)-

4、gLt在原核表達(dá)系統(tǒng)中的最高表達(dá)水平，最終確定pET32a(+)-gLt重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件是于BL21(DE3)表達(dá)菌中，37℃條件下，0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8h。獲得的gLt重組蛋白的大小約為35kDa，重組蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果表明其具有較好的反應(yīng)原性，而且純化后的重組蛋白，其純度能夠達(dá)到制備兔抗gLt重組蛋白血清的標(biāo)準(zhǔn)。將純化的gLt重組蛋白免疫家兔，然后分、離出血清，并檢測(cè)其效價(jià)可達(dá)到1∶3

5、2。最后將收集的血清經(jīng)過(guò)飽和硫酸銨粗提以及HighQ陰離子交換層析純化，凍干好后保存于-70℃。
　　3、鴨瘟病毒UL1蛋白的亞細(xì)胞定位研究
　　通過(guò)構(gòu)建和優(yōu)化間接免疫熒光檢測(cè)方法，以觀察DPV gL蛋白在感染了DPV的鴨胚成纖維細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)分布。結(jié)果顯示:DPV感染2h、7h時(shí)未觀察到明顯的特異性熒光，感染12h開(kāi)始觀察到特異性熒光，呈顆粒狀彌散分布于細(xì)胞漿內(nèi);從12h到36h之間，可以明顯觀察到彌散分布的gL蛋白開(kāi)始慢慢

6、聚集起來(lái);感染46h，gL蛋白完全聚集濃縮為一個(gè)單一的點(diǎn)，并且極化分布于細(xì)胞核一側(cè);感染至60h，隨著細(xì)胞核開(kāi)始發(fā)生皺縮或裂解，此時(shí)UL1基因編碼蛋白又變成彌散分布的狀態(tài)。
　　4、鴨瘟病毒UL1基因類型的分析與表達(dá)時(shí)相分析
　　本試驗(yàn)利用藥物抑制分析UL1基因的類型及采用Western blot法研究DPV UL1基因在感染了DPV的鴨胚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相。在更昔洛韋、放線菌素兩種抑制劑的分別作用下，均不能檢測(cè)到UL1

7、基因，這說(shuō)明UL1基因應(yīng)該屬于DPV的一個(gè)晚期基因。而表達(dá)時(shí)相結(jié)果顯示病毒感染細(xì)胞4h，未能在26kDa附近未能找到相應(yīng)條帶，當(dāng)病毒感染后8h，才觀察到相應(yīng)的蛋白條帶;感染24h，gL蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大，隨后開(kāi)始逐漸下降，表明DPV gL蛋白屬于晚期蛋白。
　　5、鴨瘟病毒UL1蛋白與gH蛋白相互作用的初步探究
　　為探究DPV UL1蛋白與gH蛋白之間的相互作用，我們利用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)，將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pCMV