與豬輪狀病毒VP6蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白研究.pdf

1、豬輪狀病毒(PoRV)是引起幼齡仔豬發(fā)生急性胃腸炎的主要病原，一般通過(guò)接觸病畜的排泄物后經(jīng)糞口途徑進(jìn)行傳播，呈地方性流行。目前在我國(guó)流行范圍較廣的是A群PoRV，在豬群中流行率為3.3％～67.3％，其中G9型毒株呈再度流行趨勢(shì)。PoRV單純感染或與其它病原（豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬圓環(huán)病毒等）混合感染，直接或間接地影響豬群生產(chǎn)力，嚴(yán)重制約了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，深入了解PoRV在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程

2、，研究病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用機(jī)制，對(duì)于有效控制疫病流行、降低對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害極為迫切和重要。
　　本研究將實(shí)驗(yàn)室分離的Rotavirus A pig/China/NMTL/2008/G9P[23]毒株（簡(jiǎn)稱NMTL株）作為研究對(duì)象，該毒株對(duì)豬有較強(qiáng)致病力，豬也是輪狀病毒主要的儲(chǔ)存宿主，存在動(dòng)物病原傳染給人的潛在危險(xiǎn)，因此具有重要的研究?jī)r(jià)值。PoRV VP6蛋白是病毒粒子最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒粒子三層衣殼結(jié)構(gòu)的中間層。它

3、與病毒脫殼釋放至胞漿中的雙層病毒粒子(DLPs)的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。根據(jù)研究報(bào)道，VP6蛋白在病毒感染細(xì)胞中與不同細(xì)胞蛋白發(fā)生一系列相互作用，在病毒的復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但對(duì)參與這個(gè)過(guò)程的細(xì)胞蛋白以及有關(guān)功能仍不十分清楚。
　　在本研究中，采用RT-PCR方法擴(kuò)增出PoRVNMTL株VP6基因cDNA全長(zhǎng)，將VP6 PCR產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得pGEX-PoRV-VP6重組質(zhì)粒，

4、測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，獲得GST-VP6重組蛋白。利用GST pull-down技術(shù)和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析鑒定，發(fā)現(xiàn)了3種與PoRV VP6蛋白存在相互作用的細(xì)胞蛋白，分別是:β-肌動(dòng)蛋白(beta-actin)、原肌球蛋白1型(TPM1)以及40S核糖體蛋白S16(RPS16)，并通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)試驗(yàn)加以驗(yàn)證。此外，還對(duì)PoRV VP6蛋白與β-肌動(dòng)蛋白相

5、互作用進(jìn)行了后續(xù)研究:用siRNA干擾敲低細(xì)胞β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量后，感染PoRV，用western blot方法檢測(cè)細(xì)胞裂解物中VP6蛋白表達(dá)量變化，用高通量?jī)?nèi)涵篩選系統(tǒng)檢測(cè)釋放至培養(yǎng)液上清中病毒的感染率。通過(guò)熒光定量qRT-PCR方法，檢測(cè)接毒后不同時(shí)間釋放至培養(yǎng)液上清中的病毒含量，確定PoRV一輪復(fù)制周期所需時(shí)間。結(jié)合電鏡觀察和VP6蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果，確定PoRV的不同復(fù)制階段。分別在PoRV不同復(fù)制階段（接毒后0h/2h/4h/

6、6h），用肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑CytoD處理感染細(xì)胞，用熒光定量qRT-PCR方法檢測(cè)接毒后8h釋放至培養(yǎng)液上清中的病毒含量差異，確定抑制肌動(dòng)蛋白聚合作用對(duì)PoRV增殖釋放的影響。雙免疫熒光染色后在共聚焦顯微鏡下觀察PoRVVP6蛋白與β-肌動(dòng)蛋白在感染細(xì)胞中是否共定位，用免疫電鏡觀察PoRV VP6蛋白在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)送途徑。用氯化銫不連續(xù)密度梯度離心方法制備PoRV DLPs，通過(guò)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(ABPs) spin-down試驗(yàn)確定P

7、oRV DLPs能否在體外增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白的聚合作用。
　　通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)，β-肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白1型、40S核糖體蛋白S16，是PoRV感染過(guò)程中與VP6蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白。這3種蛋白廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，在各物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守，病毒在體內(nèi)增殖，利用容易獲得的細(xì)胞蛋白，有助于增強(qiáng)病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性，擴(kuò)大病毒感染的組織范圍，也為RV的跨種間傳播提供了可能。
　　用PoRV感染siRNA干擾敲低β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)量的

8、細(xì)胞，病毒VP6蛋白合成和病毒粒子釋放顯著降低。MA104細(xì)胞經(jīng)siACTB轉(zhuǎn)染72h后，感染PoRV NMTL株48h，細(xì)胞裂解物中PoRVVP6蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低;將上述處理后收集到的上清樣品感染MA104細(xì)胞18h后，siACTB處理組PoRV感染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，明顯少于未處理組、Mock組、siFAM組等對(duì)照組。以上研究證實(shí)，PoRV VP6與β-肌動(dòng)蛋白相互作用，能夠有效介導(dǎo)病毒感染，在胞漿中運(yùn)輸DLPs、起始mRN

9、A轉(zhuǎn)錄翻譯合成病毒蛋白、組裝和釋放TLPs過(guò)程中起重要作用。
　　雙免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，帶有不同熒光標(biāo)記的PoRV VP6蛋白和β-肌動(dòng)蛋白，在病毒感染細(xì)胞的胞漿中共定位。免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在PoRV感染早期，帶有膠體金標(biāo)記的VP6蛋白位于肌動(dòng)蛋白微絲上，此后VP6蛋白分布于感染細(xì)胞核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核中。研究結(jié)果表明，PoRV DLPs在感染細(xì)胞中依賴肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)的特定位置進(jìn)行復(fù)制。這些發(fā)現(xiàn)揭示了P

10、oRV VP6蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸途徑，以及參與PoRV復(fù)制的細(xì)胞成分。
　　ABPs spin-down試驗(yàn)體外證實(shí)，PoRV VP6蛋白結(jié)合至肌動(dòng)蛋白微絲上，但DLPs并不能增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白的聚合活性。通過(guò)這2種蛋白之間的相互作用，PoRV DLPs劫持了細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架系統(tǒng)，使它在細(xì)胞中像“貨物”一樣被運(yùn)輸至特定的細(xì)胞器中，以便于病毒復(fù)制。但在體內(nèi)PoRV感染過(guò)程中，VP6蛋白是否招募其它宿主細(xì)胞蛋白（如:本研究已證實(shí)的VP