輪狀病毒抗原蛋白VP4基因重組載體疫苗研究.pdf

1、輪狀病毒（rotavirus，RV）感染是引起嬰幼兒重癥腹瀉最重要的因素之一，也是造成發(fā)展中國(guó)家兒童死亡的重要原因。在世界各國(guó)，90％以上的嬰兒在3歲之前均受到了RV的感染，在5歲以下腹瀉住院患兒中，RV感染病例占20％--70％，5歲以上的兒童幾乎全都感染過(guò)RV。美國(guó)每年與輪狀病毒感染有關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)3-10億元，可見(jiàn)輪狀病毒腹瀉不僅影響了全球兒童的健康，而且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有效的疫苗接種可以顯著減少由RV引起的兒童重癥腹瀉，也

2、是唯一可行的預(yù)防控制RV較高發(fā)病率和死亡率的方法[1-2]。 輪狀病毒顆粒由3層組成：外部衣殼、內(nèi)部衣殼和核心。外部衣殼由VP7和VP4組成。VP7形成相對(duì)光滑的外表面，VP4組成釘狀突起，二者都是中和抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。VP4還在病毒感染過(guò)程中扮演重要的作用，作為一種細(xì)胞結(jié)合蛋白，VP4經(jīng)胰酶切割后可增強(qiáng)輪狀病毒對(duì)宿主的感染性。因此，以輪狀病毒外殼蛋白基因VP4基因，將其重組到原核表達(dá)載體上，以研究病原基因在宿主菌中

3、的表達(dá)情況，為新型口服疫苗的研究奠定基礎(chǔ)[3-5]。 目的：構(gòu)建攜帶輪狀病毒外殼蛋白VP4基因的重組質(zhì)粒（即pBEX/VP4），檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)，并對(duì)重組載體表達(dá)蛋白的安全性進(jìn)行驗(yàn)證。 方法：（1）根據(jù)Genbank中鼠源VP4的基因序列設(shè)計(jì)34對(duì)引物，通過(guò)重疊PCR合成VP4基因。以pGEX-5x-1為基礎(chǔ)，構(gòu)建穿梭表達(dá)載體pBEX，并將合成的VP4基因重組入pBEX，得到重組質(zhì)粒pBEX/VP4。（2）將其轉(zhuǎn)化大腸

4、桿菌，SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白的表達(dá)。通過(guò)腸袢實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)蛋白的安全性。 結(jié)果：（1）測(cè)序表明，合成的VP4基因正確，并成功構(gòu)建了穿梭載體pBEX/VP4。（2）VP4蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，其表達(dá)蛋白經(jīng)腸袢實(shí)驗(yàn)證實(shí)是無(wú)毒的。 結(jié)論：（1）在沒(méi)有模板的情況下，重疊PCR法可以用來(lái)合成目的基因；（2）VP4蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，說(shuō)明穿梭載體的構(gòu)建是成功的，而腸袢實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了表達(dá)蛋白的安全性，為以后將重組穿梭載體轉(zhuǎn)入宿主菌