表達豬輪狀病毒VP4基因和共表達VP4與LTB重組乳酸菌表達系統(tǒng)的構建及其免疫學評價.pdf

1、豬輪狀病毒是無囊膜、分節(jié)段的雙股RNA病毒，隸屬于呼腸孤病毒科，是引起仔豬腹瀉的重要病原之一。豬輪狀病毒感染呈世界范圍分布，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的危害。本研究以乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000和干酪乳桿菌LactobacilluscaseiATCC393(Lcasei393)作為遞呈抗原的活菌載體，以豬輪狀病毒主要免疫保護性抗原VP4蛋白的基因片段為靶基因，并插入大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基因(LTB)，構建了表達豬

2、輪狀病毒VP4基因和共表達VP4-LTB的重組乳酸乳球菌表達系統(tǒng)和干酪乳桿菌表達系統(tǒng)，并對免疫效果進行了比較分析。 ⑴根據(jù)目的基因和融合表達載體質粒的特點，應用olig06.0軟件進行設計引物。以VP4-pGEX-6P-1質粒作為模板，通過PCR擴增得到大約756bp的VP4基因，以pMD-18T-LTB質粒作為模板，通過PCR擴增得到大約375bp的LTB基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后，與帶有粘性末端的pNZ8112載體連接，得到p

3、NZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB的質粒。重組質粒pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB分別電轉化乳酸乳球菌NZ9000，得到重組菌pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB，然后將重組菌進行酶切、PCR鑒定和測序分析。以同樣方法得到pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB重組菌，然后進行酶切、PCR鑒定和測序分析。 ⑵構建的重組菌pNZ8112-VP4和pYZ8112-VP4

4、-LTB在GM17培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過Nisin來誘導目的蛋白的表達。重組菌中蛋白的表達和定位通過SDS-PAGE、Westernblotting和免疫熒光進行鑒定?？捡R斯亮藍染色結果顯示：pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB的菌體裂解物分別表達了27KD和40KD的融合蛋白，而誘導前的菌體沒有目的蛋白表達。誘導后表達的VP4和VP4-LTB蛋白經(jīng)Westernblotting分析，可檢測到27KD和40KD的特異性反應

5、條帶，誘導前的菌體沒有相應的條帶出現(xiàn)。這些結果表明Nisin能有效誘導乳酸乳球菌NZ9000中異源蛋白的表達。采用抗VP4的鼠血清進行免疫熒光試驗的結果顯示，pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LXB誘導后的菌體表面能看到黃綠色熒光，而誘導前的菌體則沒有熒光反應，且細胞被伊文思藍染成紅色。 ⑶構建的重組菌pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB在MRS培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，利用乳糖來誘導目的蛋白的表達。重組菌目的蛋

6、白的表達和定位也是通過SDS-PAGE、Westernblotting和免疫熒光來鑒定?？捡R斯亮藍染色可看到pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB的菌體裂解物分別有大約40KD和53KD的蛋白表達，而未誘導的菌體中沒有蛋白表達。通過Westernblotting檢測誘導后的菌體裂解物，可看到40KD和53KD的特異性反應條帶，而未誘導的菌體則沒有相應的條帶出現(xiàn)，這些結果表明乳糖能有效誘導L.casei393中異源蛋白的表達。通過

7、間接免疫熒光方法鑒定，pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB的菌體表面均能看到黃綠色熒光，而未誘導的菌體則沒有熒光反應，且細胞被伊文思藍染成紅色。 ⑷為檢驗重組菌是否能誘導黏膜和系統(tǒng)免疫應答，將BALB/c小鼠分為六組，通過口服途徑分別免疫pPG-1，pPG-1-VP4，pPG-1-VP4-LTB，pNZ8112，pNZ8112-VP4和pNZ8112-VP4-LTB。每只小鼠分別免疫109c.f.u.單位的重組菌，每次

8、連續(xù)免疫三天，第一次加強免疫在第一次免疫后的17、18、19天，第二次加強免疫在第一次免疫后的33、34、35天。每次免疫后的第7天收集小鼠血清；每次免疫后的1、2、7天收集糞便；眼洗液是在每次免疫后的第7天以50μL的PBS沖洗眼結膜獲得；陰道洗液是在每次免疫后的第7天用200μL的PBS沖洗陰道獲得；母鼠分娩后的3、5、7天收集乳汁。所有收集的樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?⑸為保持黏膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，許多防御機制都參與進行持久有效地

9、作用。分泌性IgA的參與也是防御機制之一，IgA抗體通過阻止病原微生物的入侵和定植并競爭受體和代謝底物。為評價黏膜免疫反應，通過ELIASA方法來檢測黏膜樣品中特異性IgA抗體的水平。在糞便、眼洗液和陰道洗液中我們檢測到了高水平的特異性IgA，與對照組相比差異顯著。其中免疫pPG-1-VP4的小鼠中特異性IgA抗體水平高于免疫pNZ8112-VP4的小鼠，免疫pPG-1-VP4-LTB的小鼠中特異性IgA抗體水平也高于免疫pNZ8112

10、-VP4-LTB的小鼠，這是因為L.casei393同LactococcuslactisNZ9000相比具有更好的腸道定植能力。免疫pPG-1-VP4-LTB和pNZ8112-VP4-LTB的小鼠糞便、眼洗液和陰道樣品中：IgA抗體水平均高于免疫pPG-1-VP4和pNZ8112-VP4的小鼠。這是由于添加了黏膜免疫佐劑LTB的緣故，表明LTB能加強黏膜系統(tǒng)反應。具有低免疫原性的疫苗尤其需要強有力的佐劑來加強抗原遞呈，本研究證明LTB作

11、為一種安全有效的佐劑具有極大的潛力。 ⑹免疫pPG-1-VP4和pPG-1-VP4-LTB的小鼠血清中IgG的效價相當，但都高于免疫pPG-1的對照組。免疫pNZ8112-VP4和pNZS112-VP4-LTB的小鼠血清中IgG抗體的效價相當，但都高于免疫pNZ8112的對照組。在本研究中，口服免疫表達VP4和VP4-LTB的重組乳酸菌不僅能誘導產(chǎn)生黏膜免疫，而且誘導產(chǎn)生了系統(tǒng)免疫。通過口服免疫產(chǎn)生的黏膜免疫反應不只局限于胃腸道

12、，也引起了其他黏膜部位的免疫反應。IgA抗體能和抗原結合并阻止其進入，降低炎性反應的程度，從而阻止了對組織的損傷，通過分泌性IgA抗體在黏膜表面對病原體進行排斥和清除，這對預防輪狀病毒感染是至關重要的。 ⑺將新分離的免疫鼠脾細胞稀釋成5×106個/mL并培養(yǎng)66h，分別用0.5μg/mL，5μg/mL和25μg/mL的VP4抗原進行刺激，收獲培養(yǎng)上清用于檢測細胞因子。脾淋巴細胞的增殖通過EIASA進行檢測，結果表明0.5μg/m