豬A組輪狀病毒VP6基因真核表達載體構建與免疫效果對比檢測.pdf

1、用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術，從豬A組輪狀病毒的總RNA中擴增了1172bp的VP6基因。通過T4DNA連接酶將其直接連接于克隆質粒載體pMD-18-T中，轉化至受體菌JM109中，通過質粒提取、酶切鑒定、PCR鑒定、序列測定，證明重組質粒pMD-18-T-VP6中含有輪狀病毒VP6基因。經氨基酸序列分析，表明克隆了輪狀病毒的主要保護性抗原VP6全基因的抗原表位區(qū)。 用限制性內切酶BamHI和KpnI將VP6基因從

2、pMD-18T-VP6進行酶切；同樣用BamHI和KpnI雙酶切表達栽體pVAX1，將這2個雙酶切產物回收、連接轉化，通過質粒提取及酶切鑒定證明完成了pVAX1-VP6真核表達栽體的構建。將重組質粒應用脂質體法轉染至MA-104細胞，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達。應用RT-PCR技術進行檢測。結果顯示，構建了VP6基因的真核表達質粒pVAX1-VP6，用其轉染MA-104細胞后可檢測到綠色熒光蛋白的表達，同樣應用RT-PCR技術

3、檢測了pVAX1-VP6mRNA的表達情況。 將實驗動物BABL/c小鼠隨機分為A、B、C3組，A組肌肉注射真核表達載體pVAX1，B組肌肉注射重組質粒pVAX1-VP4+pVAX1-VP7；C組為三聯(lián)免疫組，肌肉注射重組真核表達質粒pVAX1-VP6+pVAX1-VP4+pVAX1-VP7。每只鼠100μg/100μL，共免疫3次，每次間隔2周：首次免疫第0，14，28，42天眼球取血后無菌取脾，進行ELISA檢測及脾臟淋巴細