豬A組輪狀病毒VP6基因真核表達(dá)載體構(gòu)建與免疫效果對(duì)比檢測.pdf

1、用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，從豬A組輪狀病毒的總RNA中擴(kuò)增了1172bp的VP6基因。通過T4DNA連接酶將其直接連接于克隆質(zhì)粒載體pMD-18-T中，轉(zhuǎn)化至受體菌JM109中，通過質(zhì)粒提取、酶切鑒定、PCR鑒定、序列測定，證明重組質(zhì)粒pMD-18-T-VP6中含有輪狀病毒VP6基因。經(jīng)氨基酸序列分析，表明克隆了輪狀病毒的主要保護(hù)性抗原VP6全基因的抗原表位區(qū)。 用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI將VP6基因從

2、pMD-18T-VP6進(jìn)行酶切；同樣用BamHI和KpnI雙酶切表達(dá)栽體pVAX1，將這2個(gè)雙酶切產(chǎn)物回收、連接轉(zhuǎn)化，通過質(zhì)粒提取及酶切鑒定證明完成了pVAX1-VP6真核表達(dá)栽體的構(gòu)建。將重組質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至MA-104細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，構(gòu)建了VP6基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VP6，用其轉(zhuǎn)染MA-104細(xì)胞后可檢測到綠色熒光蛋白的表達(dá)，同樣應(yīng)用RT-PCR技術(shù)

3、檢測了pVAX1-VP6mRNA的表達(dá)情況。 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BABL/c小鼠隨機(jī)分為A、B、C3組，A組肌肉注射真核表達(dá)載體pVAX1，B組肌肉注射重組質(zhì)粒pVAX1-VP4+pVAX1-VP7；C組為三聯(lián)免疫組，肌肉注射重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VP6+pVAX1-VP4+pVAX1-VP7。每只鼠100μg/100μL，共免疫3次，每次間隔2周：首次免疫第0，14，28，42天眼球取血后無菌取脾，進(jìn)行ELISA檢測及脾臟淋巴細(xì)