豬輪狀病毒VP7基因在栗酒裂殖酵母中的表達(dá)及鑒定.pdf

1、豬輪狀病毒(PRV)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，為無囊膜、雙股RNA病毒。該病毒是引起嬰幼兒及多種幼齡動物急性腹瀉并致死亡的主要病原體。在養(yǎng)豬生產(chǎn)上，A組PRV是引起幼豬腹瀉的主要病毒性病原體之一。幼豬感染PRV后，因腹瀉使機(jī)體免疫力急劇下降，易繼發(fā)多種細(xì)菌性感染，導(dǎo)致幼豬成活率下降，存活者生長緩慢或停滯，給養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。PRV含有11個節(jié)段的基因組，他們編碼9種蛋白，即結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP

2、7和非結(jié)構(gòu)蛋白NS34、NS35及NS28。其中構(gòu)成病毒外殼主要成分的VP7蛋白，是劃分病毒血清型的依據(jù)，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體的最主要抗原。因此對該基因的克隆及其在酵母菌中的轉(zhuǎn)化、表達(dá)、鑒定，對于進(jìn)一步研究VP7蛋白在植物中的表達(dá)及研制PRV基因工程疫苗都具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)以RG-2質(zhì)粒為模板，根據(jù)VP7完整序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1000bp左右的特異片段。將其連接到pMD18-T載體上，通過篩選培養(yǎng)在加

3、IPTG、X-gal和Amp的LB培養(yǎng)基上的白斑，得到重組質(zhì)粒pMD18-T-VP7，經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證了PCR產(chǎn)物已克隆到pMD18-T-VP7重組質(zhì)粒中。 用NheⅠ和BglⅡ酶切經(jīng)PCR擴(kuò)增的VP7基因產(chǎn)物，而后用AlkalinePhosphatase(Calfintestine)酶對雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行了去磷酸化，防止VP7片段自連；純化產(chǎn)物后在T4DNA連接酶的作用下，將其定向克隆到經(jīng)NheⅠ和BglⅡ酶切后的pESP-2

4、質(zhì)粒上，構(gòu)建成含有VP7基因的酵母重組表達(dá)載體pESP-2-VP7。以熱激、電擊和LiAC轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pESP-2-VP7導(dǎo)入栗酒裂殖酵母SP-Q01中。通過在不含亮氨酸的EMM+VB1培養(yǎng)基篩選，鑒定重組pESP-2-VP7陽性質(zhì)粒，并用PCR、雙酶切和SDS-PAGE電泳方法分別對轉(zhuǎn)入DH5a和SP-Q01中的重組質(zhì)粒進(jìn)行了鑒定。PCR檢測重組質(zhì)粒含有目的片段，對目的片段測序，與VP7完整序列對照，相似度為98.8﹪；雙酶切重組