利用花粉管通道法將輪狀病毒VP7基因轉(zhuǎn)化番木瓜的研究.pdf

1、本研究將攜帶VP7基因的pBIVP7質(zhì)粒酶切，去除NptⅡ基因片段，獲得線性化無(wú)選擇標(biāo)記載體MFpBIVP7-1和MFpBIVP7-2。通過(guò)花粉管通道法，將pBIVP7質(zhì)粒DNA和MFpBIVP7-1和MFpBIVP7-2載體DNA(均攜帶組成型啟動(dòng)子CaMV35S)導(dǎo)入番木瓜。采用正交試驗(yàn)觀察導(dǎo)入外源DNA類(lèi)型、DNA濃度、DNA注入時(shí)間三因子對(duì)番木瓜花粉管通道法轉(zhuǎn)基因在座果率、成株率、轉(zhuǎn)化率的影響，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行VP7基因、NP

2、TⅡ基因的PCR檢測(cè)和RT-PCR、Westernblot、ELISA等一系列分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明： 1)綜合考慮外源DNA類(lèi)型、DNA濃度、DNA注入時(shí)間在番木瓜花粉管通道法遺傳轉(zhuǎn)化上對(duì)坐果率、成株率和轉(zhuǎn)化率三方面的影響，DNA類(lèi)型、DNA濃度、DNA注入時(shí)間的最佳組合是：DNA類(lèi)型選擇線狀DNA，DNA片段大小在保證帶有完整目的基因DNA片段、DNA供體性狀能夠表達(dá)的前提下，選擇10Kb以下的小DNA片段；DNA注入時(shí)間

3、選擇在授粉后第5天；DNA濃度控制在1000μg/ml。坐果率、成株率、轉(zhuǎn)化率可達(dá)一個(gè)最佳綜合水平。 2)通過(guò)花粉管通道法成功將pBIVP7載體、MFpBIVP7-1載體、MFpBIVP7-2載體轉(zhuǎn)化番木瓜。 3)對(duì)所獲得的269株轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行VP7基因的PCR檢測(cè)，獲得21株陽(yáng)性株。這21株陽(yáng)性株經(jīng)朋NPTⅡ基因的PCR檢測(cè)，pBIVP7轉(zhuǎn)化植株中有2株的NptⅡ基因、VP7基因同時(shí)獲得轉(zhuǎn)化，1株表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化分離。8株M

4、FpBIVP7-1轉(zhuǎn)化植株、10株MFpBIVP7-2轉(zhuǎn)化植株檢測(cè)到VP7基因、未檢測(cè)到朋NPTⅡ基因。 4)對(duì)21株VP7基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株進(jìn)行RT-PCR分析，有3株pBIVP7轉(zhuǎn)基因植株，6株MFpBIVP7-1轉(zhuǎn)基因植株和7株MFpBIVPT-2轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出特異性條帶，2株MFpBIVP7-1轉(zhuǎn)基因植株和3株MFpBIVP7-2轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)入的VP7基因不能正常轉(zhuǎn)錄，發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。 在RTPCR

5、陽(yáng)性株中選長(zhǎng)勢(shì)良好的2株轉(zhuǎn)pBIVP7植株、4株轉(zhuǎn)MFpBIVP7-1植株和5株轉(zhuǎn)MFpBIVP7-2植株經(jīng)Westernblot和ELISA等分子生物學(xué)鑒定，確定VP7基因已轉(zhuǎn)入番木瓜基因組，并得到正確表達(dá)。5號(hào)的MFpBIVP7-1轉(zhuǎn)基因番木瓜目的蛋白的表達(dá)量最高，活性VP7蛋白占可溶性蛋白的含量為1.74‰，9號(hào)的MFpBIVP7-2轉(zhuǎn)基因番木瓜的目的蛋白表達(dá)量排第2，活性VP7蛋白占可溶性蛋白的含量為1.20‰。 5)獲