中國不同地區(qū)A、B組輪狀病毒分離株VP7基因序列的比較分析.pdf

1、目的： 研究從我國大慶地區(qū)嬰幼兒腹瀉臨床糞便標(biāo)本中分離的一株A組人輪狀病毒陽性毒株(命名為DQ-1株)VP7基因的基因分型，對DQ-1株VP7基因序列和糖蛋白VP7的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并與已測序同血清型標(biāo)準(zhǔn)株和國內(nèi)外地方株VP7基因序列進(jìn)行序列比對。 方法： 通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增人A組輪狀病毒DQ-1株VP7全長基因，并將RT-PCR)產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨

2、芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落后挑取白色菌落進(jìn)行檢測，從中篩選出兩個(gè)PCR陽性菌落，并提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，最后利用通用引物進(jìn)行測序。利用DNAStar軟件對DQ-1株VP7基因測序序列與其他A組輪狀病毒株VP7基因序列進(jìn)行同源性比較；用RNAstructure4.4軟件繪制DQ-1株VP7基因的二級結(jié)構(gòu)；用Predictprotein軟件對DQ-1株糖蛋白VP7蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。 結(jié)果： DQ-1株VP7基

3、因與同型的我國已測序G1型地方株T73、R96-197株基因序列同源性均為97.6﹪，與G1型標(biāo)準(zhǔn)株Wa株核苷酸序列同源性為92.9﹪，與G2血清型代表株DS-1株基因序列同源性為73.8﹪，與G3血清型代表株SA11株核甘酸序列同源性為75.6﹪，與G4血清型代表株J-4621株(78.1﹪)同源性也不高；其VP7基因mRNA可折疊多達(dá)20個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)。DQ-1株VP7蛋白是由354個(gè)氨基酸組成的多肽，含有2個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)和多個(gè)磷酰

4、化位點(diǎn)；DQ-1株氨基酸序列與T73、R96-197株同源性都達(dá)97.5﹪，與wa株達(dá)94.6﹪，而與其它型DS-1株、SAll株和J-4621株分別僅為74.4﹪、79.4﹪和75.2﹪。因此，我們推定DQ-1株屬于Gl血清型。 結(jié)論： DQ-1株VP7基因序列與已測序我國G1型地方株VP7基因序列幾乎沒有差別，而與Gl型標(biāo)準(zhǔn)株VP7基因序列存在細(xì)微差異，這為我國人A組輪狀病毒疫苗的引進(jìn)和研制提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

5、 目的： 克隆中國不同地區(qū)四個(gè)B組成人腹瀉輪狀病毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP7基因，通過測序得到其核苷酸序列和氨基酸序列，比較與其它B組輪狀病毒毒株基因和氨基酸序列同源性，從而進(jìn)一步分析我國不同地區(qū)流行的B組成人腹瀉輪狀病毒毒株之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。 方法： 參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，對中國不同地區(qū)流行的4株B組輪狀病毒株進(jìn)行RT-PCR，并將RT-PCR產(chǎn)物克隆到PCR Ⅱ載體，轉(zhuǎn)化E．Coli感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒

6、經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切分析，從中篩選陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果采用DNAStar6.0進(jìn)行多重序列比對分析，并與B組輪狀病毒代表株和其它已測序地方株的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，繪制系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。 結(jié)果： 本研究獲得的4株B組成人腹瀉輪狀病毒株核苷酸序列同源性為97.3﹪～98.8﹪，氨基酸序列同源性為95.2﹪～99.3﹪之間；與B組成人腹瀉輪狀病毒代表株ADRV核苷酸序列同源性為98

7、.2﹪～100﹪，氨基酸序列同源性為97.4﹪～100﹪；與國外B組成人腹瀉輪狀病毒株印度、孟加拉國株核苷酸序列同源性為90.1﹪～92.5﹪，氨基酸序列同源性為92．3﹪～95．6﹪。 結(jié)論： 研究表明所有B組成人腹瀉輪狀病毒毒株均屬于同一血清型，這為成人腹瀉輪狀病毒的流行病學(xué)監(jiān)測以及將來研制成人腹瀉輪狀病毒疫苗提供了分子生物學(xué)依據(jù)，同時(shí)本研究可以從分子病毒學(xué)理論上證明“病毒是以居群的形式存在的”和“病毒的居群內(nèi)部存在