豬輪狀病毒流行毒株的分離及部分特性鑒定.pdf

1、豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PRV)屬呼腸病毒科，輪狀病毒屬。豬輪狀病毒是引起仔豬病毒性腹瀉常見的病原之一，主要臨床癥狀表現(xiàn)為黃色水樣腹瀉并伴隨著嘔吐。因該病流行范圍廣，發(fā)病率高，常與其他疾病混合感染而使病情加重，導致高死亡率，給畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。
　　輪狀病毒血清群和血清型眾多，且不同毒株的生物學特性不同，故對輪狀病毒的分離鑒定及相關特性的研究，無論是對該病毒的基礎性研究亦或是對該病的應用性研究均具有十

2、分重要的意義。
　　本研究對2012年從河北某發(fā)病豬場采集的仔豬腹瀉病料進行了輪狀病毒的分離鑒定。首先對疑似病料，進行了PRV VP6部分基因的PCR檢測，對擴增產(chǎn)物測序證明，獲得的275bp的PRV VP6部分基因序列，同時對TGEV和PEDV進行了RT-PCR擴增，未見針對這兩種病毒的特異條帶。結果表明該病料中含有輪狀病毒。將PRV PCR檢測陽性糞便10倍稀釋，經(jīng)病毒釋放和無菌處理后，分別接種于豬小腸上皮細胞IEC-2、恒河

3、猴胎腎細胞MA-104和Marc-145，經(jīng)過一定代次的盲傳，在以上三種細胞基質(zhì)中均可觀察到細胞膜融合，細胞核固縮、空泡化，細胞脫落等細胞病變(CPE)，且隨著傳代次數(shù)的增加，CPE也越發(fā)明顯;對該輪狀病毒地方流行株的細胞培養(yǎng)物進行電鏡觀察，可觀察到典型的車輪狀病毒結構，病毒呈雙層衣殼，直徑大小約70～80nm;免疫電鏡檢測，可見有大量的典型的輪狀病毒粒子聚集在一起;病毒感染MA-104細胞后不同時間超薄切片電鏡觀察顯示，病毒接種30h

4、在胞質(zhì)中可見典型的病毒粒子，60h時病毒明顯增多，90h后細胞失去固有形態(tài);間接免疫熒光檢測表明，接種該輪狀病毒分離株的IEC-2細胞、MA-104細胞和Marc-145細胞中均有特異性免疫熒光出現(xiàn);病毒中和實驗表明，分離病毒所致病變，可被特異性豬輪狀病毒抗血清所抑制。為進一步純化該病毒，將病毒感染的細胞培養(yǎng)物與氯仿連續(xù)作用5代后在MA-104細胞上擴大培養(yǎng)，利用雙層瓊脂法進行蝕斑試驗，通過多次挑取蝕斑在細胞上培養(yǎng)，達到了病毒的純化。<

5、br>　　本實驗對所分離的毒株進行了部分理化特性的測定。測定結果表明，該輪狀病毒地方流行分離株對脂溶性試劑表現(xiàn)出極度不敏感，pH3.0處理病毒1h后其感染能力略微下降，經(jīng)50℃水浴處理30min后，感染能力明顯下降。
　　將分離毒細胞培養(yǎng)物灌服新生仔豬后，30h開始輕微腹瀉，70h后出現(xiàn)嘔吐和水樣腹瀉，感染后96h死亡。剖檢腸壁變薄，松弛胃內(nèi)充滿凝乳塊，對所收集的糞便樣品進行PCR檢測和免疫熒光檢測，均為陽性，表明所分離的病毒對豬