我國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的亞型鑒定和分離株增殖特性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，其病毒粒子無囊膜，基因組是由一條單股、負鏈、環(huán)狀的DNA組成。PCV有PCV1和PCV2兩個基因型，PCV1對豬是非致病性的，PCV2是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的主要病原，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。PCV2主要分為五個亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。本論文主要是對PCV2的亞型鑒定、PCV2的定量檢測方法、PCV

2、2a和PCV2b在PK15細胞上的增殖特性、PCV2a和PCV2b在Balb/c小鼠體內(nèi)的增殖特性進行了研究。本文為PCV2的遺傳變異、臨床診斷和增殖特性的研究提供了一定的技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。本論文主要內(nèi)容如下:
　　試驗1.我國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的亞型鑒定
　　PCV2在我國各省市均有流行，為了了解2011至2012年間江蘇、浙江和安徽三省部分豬場PCV2流行毒株的遺傳變異情況，本研究利用PCV2檢測引物從臨床送檢樣品

3、中篩選出28份陽性病料，利用兩對PCV2全長擴增引物對陽性病料進行PCV2全長擴增和測序，然后對它們進行遺傳進化分析。結(jié)果表明，全長序列為1767bp的有25個，為1768bp的有2個，為1766bp的有1個;28個毒株之間的核苷酸同源性為94.2％-100％，與13個參考毒株的核苷酸同源性為93.9％-100％;有3株為PCV2a，1株為PCV2b，24株為PCV2d，沒有PCV2c和PCV2e。這表明當前主要的流行毒株是PCV2d。

4、
　　試驗2.兩種豬圓環(huán)病毒2型TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用
　　依據(jù)PCV2ORF1和ORF2基因的相對保守序列，分別設(shè)計合成兩組特異性引物和TaqMan探針，構(gòu)建分別包含PCV2ORF1和ORF2基因全長的重組質(zhì)粒作為標準品，經(jīng)過反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，繪制標準曲線，建立了兩種檢測PCV2的TaqMan實時熒光定量PCR方法。所建立的兩條標準曲線的Ct值與起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系

5、，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上，擴增效率均在90％-110％之間;重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)均小于5％;特異性強;敏感性高，ORF1方法可達1.0×101copies/μL，ORF2方法可達1.0×102copies/μL。分別用兩種方法對臨床樣品進行檢測并比較檢測結(jié)果。結(jié)果表明，由于一些臨床樣品中P1的存在，基于ORF1建立的定量檢測方法更為準確、特異性更強，可用于PCV2的快速診斷和定量檢測。
　　試驗3.豬圓環(huán)病毒2型兩亞型分離

6、株在PK15細胞上的增殖特性研究
　　為了研究豬圓環(huán)病毒2型的兩個主要亞型，即PCV2a和PCV2b在體外的增殖特性，我們分別將本實驗室分離的PCV2a和PCV2b毒株接種PK15細胞進行連續(xù)傳代，對兩亞型毒株的體外增殖特性進行了研究。利用熒光定量PCR方法對各代次病毒含量進行定量檢測，利用細胞免疫熒光方法對第10代、20代、30代、40代、50代、60代細胞毒進行TCID50測定，比較兩亞型毒株在體外的增殖特性。研究結(jié)果表明，隨

7、著傳代次數(shù)的增加，兩亞型病毒的感染滴度均有明顯的提高，但是PCV2b的增殖速度要明顯高于PCV2a的。
　　試驗4.豬圓環(huán)病毒2型兩亞型分離株在Balb/c小鼠體內(nèi)的增殖特性研究
　　為了研究PCV2a和PCV2b兩亞型毒株在Balb/c小鼠體內(nèi)的增殖特性，本文將兩亞型毒株分別接種Balb/c小鼠，利用熒光定量PCR、ELISA等方法對小鼠各臟器中的病毒含量、血清中病毒和抗體水平等指標進行了研究。結(jié)果表明，PCV2a和PCV