豬A組輪狀病毒VP6基因的克隆與表達.pdf

1、RV主要保護性抗原基因已經(jīng)被克隆和測序,但迄今為止報道的表達載體系統(tǒng),多是以抗生素抗性作為外源基因穩(wěn)定表達的壓力.以抗生素為選擇壓力,雖然對克隆子容易進行篩選,但是由于抗藥性基因不斷向環(huán)境中漂移擴散,可能造成對環(huán)境微生態(tài)的破壞,帶來嚴重后果,因而這類表達系統(tǒng)也離"食品級"還有很大的距離,不能直接用于人和動物.非抗性表達載體系統(tǒng)日益受到人們的關注.由于重組保護性抗原受體菌株主要是活的減毒病原菌,而細菌疫苗的免疫保護力往往和菌株的殘余毒力成

2、正比.所以試圖尋找能良好地表達外源性抗原且安全的受體菌株日益受到人們的關注.乳酸桿菌為人及動物體內(nèi)正常菌群的重要成員,以乳酸桿菌作為表達外源保護性抗原基因的受體菌株,就可以將乳酸菌的生物學功能和外源功能抗原基因的特異性免疫相結(jié)合,同時乳酸桿菌作為正常生理性細菌,又符合新型疫苗的口服安全、方便、廉價等特點.不難想象,如果將以非抗性載體表達系統(tǒng)基因為選擇壓力的"食品級"和"飼料級"系統(tǒng)構(gòu)建成功,就可以把RV的保護性抗原基因克隆入這種載體中,

3、再導入乳酸菌受體菌中,得到的這種重組工程乳酸桿菌將集益生菌和RV基因產(chǎn)物的功能于一體,其科學意義和應用前景將十分廣闊.這類疫苗的研制成功將為RV疫苗的發(fā)展探索一條新路.該研究用恒河猴胚腎細胞(MA-104細胞系)增殖并擴增了PRV.根據(jù)Genebank已發(fā)表的PRV VP6基因cDNA序列,利用Primer 5.0軟件設計并合成了一對引物,通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術,從PRV的總RNA中擴增出長1172bp的VP6基因

4、片段.通過T4 DNA連接酶將其直接連于克隆載體pGEM-T-easy中,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T-PRV6,再轉(zhuǎn)化至受體菌JM109中.然后進行質(zhì)粒提取并通過酶切、PCR鑒定、序列測定,證明重組質(zhì)粒中pT-PRV6中含有輪狀病毒VP6基因.經(jīng)氨基酸序列分析,表明克隆了輪狀病毒的主要保護性抗原VP6全基因的抗原表位區(qū).進一步將上述VP6基因克隆至pW425t的SacI和KpnI之間的多克隆位點上,該載體是以ThyA基因[33,96]為

5、選擇壓力的非抗性的可在大腸桿菌和乳酸菌之間穿梭表達的載體,將重組表達載體命名為pW425t-PRV6.經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定,將陽性克隆pW425t-PRV6在ThyA基因缺陷的大腸桿菌中進行表達.通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,表明VP6基因在大腸桿菌中得到了表達.Western-blot檢測,表明其具有免疫活性.從而為下一步在乳酸菌中表達奠定基礎.此技術平臺為PRV的免疫防制提供新的手段和可能,也為各種外源和內(nèi)源的功能