豬A組輪狀病毒Vp6基因工程乳酸菌的制備及其免疫效果檢測(cè).pdf

1、該項(xiàng)研究分為兩個(gè)階段：乳酸菌基因工程疫苗實(shí)驗(yàn)室研究階段和免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)階段?；厥占兓玫截iA組輪狀病毒 Vp6 基因以及質(zhì)粒載體pW425et。將純化的Vp6基因亞克隆至雙標(biāo)記載體 pW425et中，構(gòu)建出可以在大腸桿菌和乳酸桿菌中穿梭表達(dá)的原核表達(dá)重組質(zhì)粒 pW425et-Vp6。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入thyA基因缺陷型的大腸桿菌E.coli X13中，SDS-PAGE檢測(cè)，可見(jiàn)約48kD的融合蛋白。Western blotting

2、分析，表明蛋白具有與豬輪狀病毒多克隆抗體的反應(yīng)原性，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入乳酸桿菌中，SDS-PAGE檢測(cè)，可見(jiàn)約48kD的融合蛋白。Western blot分析，表明該蛋白同樣具有與豬輪狀病毒多克隆抗體的反應(yīng)原性。轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒的嗜酸性乳酸桿菌即為免疫用基因工程乳酸菌。 將購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的3-4周齡BALB/c小鼠分成4組，每組20只，分別是A組：空對(duì)照組；B組：普通嗜酸性乳酸桿菌組；C組：重組基因工程大腸桿菌組；4組

3、：重組基因工程乳酸桿菌組。小鼠購(gòu)進(jìn)之日起，每日定時(shí)、定量飼喂溶于脫脂牛奶中的乳酸菌。在第0、14、28、42天取小鼠糞便表層，通過(guò)間接ELISA檢測(cè)腸道特異性抗體SIgA，間接ELISA檢測(cè)血清中的特異性抗體。以及對(duì)CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)量檢測(cè)和CD<'+>19B淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的檢測(cè)。 免疫后機(jī)體在免疫水平上的變化如下：體液免疫水平顯著提高，表現(xiàn)在血清中抗輪狀病毒特異性IgA的含量明顯上

4、升，CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>、CD3<'+>/CD4<'+>、CD3<'+>/CD8<'+>、CD4<'+>/CD8<'+>T淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的變化也反應(yīng)出機(jī)體良好的免疫狀態(tài)。研究證明機(jī)體已經(jīng)通過(guò)該疫苗的免疫具備了預(yù)防輪狀病毒感染的能力。局部免疫方面，刺激腸道上皮組織中的固有層細(xì)胞分泌出了大量的 SIgA，使輪狀病毒最容易侵害的胃腸道出現(xiàn)了一種有效對(duì)抗感染的免疫環(huán)境。SIgA的含量明顯提高，是抵御輪狀病毒感染最重要