豬A組輪狀病毒VP7基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及實驗免疫研究.pdf

1、輪狀病毒是引起嬰幼兒和各種幼齡動物非細(xì)菌性腹瀉的主要病原之一。在發(fā)展中國家，每年發(fā)生中度和嚴(yán)重腹瀉的兒童約18000000人，死于輪狀病毒感染的超過350000～390000人：在發(fā)達(dá)國家，由于RV腹瀉導(dǎo)致脫水是兒童住院的一個常見病因。據(jù)估計，全球范圍內(nèi)，輪狀病毒性疾病所造成的死亡率還沒有降低。由于目前尚無治療輪狀病毒的特效藥物，因此預(yù)防顯得尤為重要。為此，世界衛(wèi)生組織多次呼吁各國科學(xué)家研制開發(fā)有效的輪狀病毒疫苗，并將其列為最優(yōu)先發(fā)展的

2、疫苗項目之一。據(jù)估計，如果使用有效的疫苗，每年在全世界可以挽救500000-1000000個兒童的生命。疫苗預(yù)防是控制此病的最佳選擇。隨著分子生物學(xué)深入研究，現(xiàn)已明確RV的2個主要外殼蛋白VP4和VP7不但是RV血清型分型依據(jù)，而且是主要的保護(hù)性抗原。因此，利用基因工程技術(shù)，將VP4、VP7基因表達(dá)出來作抗原，且VP7蛋白在抗原性和免疫原性方面強(qiáng)于VP4抗原，所以選用VP7作抗原已成為國內(nèi)外輪狀病毒基因工程苗研究的主要方向。目前，關(guān)于人

3、的輪狀病毒病的研究比較深入，但是有關(guān)動物輪狀病毒病尤其是豬的尚處于起步階段。 RV屬呼腸病毒科，RNA基因組包含11個片段，每個片段各編碼一種蛋白，6種結(jié)構(gòu)蛋白即VP1-VP4、VP6、VP7，5種非結(jié)構(gòu)蛋白即NSP1-5。關(guān)于RV感染的免疫應(yīng)答已經(jīng)在人和動物進(jìn)行了若干研究，但是抵御RV的潛在保護(hù)機(jī)制至今仍不清楚。目前的研究證明，VP4和VP7是病毒外殼上的主蛋白抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體。 本實驗旨在國內(nèi)外輪狀

4、病毒的基礎(chǔ)上，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)以測定豬輪狀病毒VP7基因序列及其在動物細(xì)胞中的表達(dá)為主要研究內(nèi)容，目的在于研究豬輪狀病毒的分子生物學(xué)特性，為研制有效的核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。在本研究中，以豬輪狀病毒總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增VP7基因，選用pGEM-Tvectorsystem成功克隆了豬輪狀病毒VP7基因。通過酶切鑒定和PCR鑒定，證實了所克隆的基因與目的基因大小一致。通過序列測定，所克隆的VP7基因序列與基因BANK中發(fā)表的VP

5、7基因序列同源性為96﹪，表明該基因在豬輪狀病毒中是高度保守的。然后將克隆至pGEM-T載體中的VP7基因與真核表達(dá)載體pVAX1進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆鑒定。然后，采用LipofectamineTM2000將真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAXI-VP7轉(zhuǎn)染至MA-104細(xì)胞中，得到了表達(dá)。以熒光抗體檢測法和RT-PCR法雙重檢測了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAXI-VP7在MA-104細(xì)胞中的表達(dá)情況。并利用陽性克隆pVAX1-VP7重組真核表達(dá)質(zhì)粒股內(nèi)側(cè)

6、肌肉注射免疫6-8周齡的BALB/c鼠，免疫3次，間隔2周/次。每次免疫前撲殺小鼠，無菌取脾，利用T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗及檢測CD3+、CD4+、CD8+和CD19+等細(xì)胞因子變化情況，并將其與VP7-VP4聯(lián)免組進(jìn)行比較。結(jié)果表明，豬A組輪狀病毒VP7全基因不但在哺乳動物細(xì)胞中獲得了表達(dá)，而且將真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAXI-VP7給動物免疫后，重組質(zhì)?？梢允剐∈髾C(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)，且VP7-VP4聯(lián)合免疫的效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于VP7單獨(dú)免疫的效果，