兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因片段的原核與真核表達(dá).pdf

1、兔瘟(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)又稱兔病毒性出血病，是由兔出血病病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種急性高致死性兔傳染病，研究該病對于經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)均具有重大意義。該病的特征病變表現(xiàn)為肝臟壞疽、出血和高死亡率。RHDV屬于嵌杯病毒屬，病毒粒子直徑30-40 nm，僅有一個較大的衣殼蛋白(60 kDa)，基因組長7.5 kb，為單股正鏈RNA，并含

2、有一個長2.2 kb的亞基因組RNA。 由于兔出血病病毒不能在現(xiàn)有的細(xì)胞系中培養(yǎng)，重組DNA技術(shù)成為獲得病毒蛋白及其特征研究的重要手段。目前尚需要建立一個檢測RHDV疫苗免疫后的抗體效價的方法，而這一方法的基礎(chǔ)就是要獲得RHDV核衣殼蛋白作為包被抗原。 通過RT-PCR方法從感染RHDV的家兔肝臟中獲得了RHDV VP60基因的cDNA序列，命名為VP60-A，并將其克隆到載體pUC19中進(jìn)行測序。序列分析顯示，該cDN

3、A與其它中國分離株同源性超過93％，而它們編碼的氨基酸序列同源性更高達(dá)96％。分別位于衣殼蛋白編碼基因中706-1740位和850-1365位(VP60-B和VP60-C)的兩個片段也通過同樣的方法進(jìn)行了克隆。隨后，將這些VP60編碼基因克隆到原核表達(dá)載體pET-30a，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-VP60A、pET-VP60B和pET-VP60C。三種RHDV衣殼蛋白基因均在大腸桿菌中獲得了表達(dá)。Western blowing顯示VP60-

4、A和VP60B-能夠與RHDV陽性血清反應(yīng)，而VP60-C不能與之反應(yīng)。 重組VP60蛋白的免疫學(xué)活性用RHDV陽性血清通過ELISA方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在相同的濃度下，VP60-A對RHDV陽性血清的免疫反應(yīng)性強(qiáng)于VP60-B和VP60-C(OD<,492>值相對較高)，故VP60-A適于作為ELISA的包被抗原。優(yōu)化后的ELISA反應(yīng)條件為抗原濃度30μg/mL，陽性血清100倍稀釋。仔兔出生后10天，母源抗體呈現(xiàn)快速下

5、降的趨勢，此后至20日齡，抗體水平繼續(xù)下降，但速度較慢。用0.5ml，1.0ml和1.5ml滅活組織疫苗免疫30日齡家兔后20天抗體水平才開始上升，35-40天達(dá)到最高峰，45天后開始呈現(xiàn)下降的趨勢。免疫1.0ml疫苗的抗體水平高于0.5ml和1.5mlVP60全長蛋白和蛋白片段還在桿狀病毒系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。VP60.A片段從pET-VP60A載體酶切并插入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)pFastBac HT A，構(gòu)建重組載體；而VP60-B和VP6

6、0-C片段則通過PCR擴(kuò)增后，同樣插入到載體pFastBac HT A中。構(gòu)建完成的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac進(jìn)行培養(yǎng)以獲得大量重組載體。抽提重組載體，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，27℃培養(yǎng)120h后，重組VP60蛋白獲得了表達(dá)。由于蛋白表達(dá)量較低，SDS-PAGE檢測不能看到重組蛋白條帶。但Westem blotting顯示，在Bac-VP60A轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解產(chǎn)物中有一條80kDa的VP60-A蛋白條帶，表明真核表達(dá)的V

7、P60-A蛋白具有較高的抗原性。用免疫熒光方法檢測發(fā)現(xiàn)僅轉(zhuǎn)染重組病毒的Sf9細(xì)胞發(fā)出熒光，再次證明了這一點。作為RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，VP60能夠自主裝配為病毒樣顆粒(VLPs)，將轉(zhuǎn)染不同重組病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液用透射電鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果僅在Bac-VP60A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣品中觀察到了VP60-VLPs的存在，空Sf9細(xì)胞、未重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和Bac-VP60B、Bac-VP60C轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均無VLPs出現(xiàn)。 基

8、于以上研究，RHDV衣殼蛋白的抗原性與蛋白長度有關(guān)，在大腸桿菌和桿狀病毒中表達(dá)的VP60-A蛋白抗原性和免疫反應(yīng)性強(qiáng)于B和C片段，能夠用于檢測自然感染或人工免疫產(chǎn)生的抗RHDV抗體。由于RHDV沒有合適的細(xì)胞系進(jìn)行繁殖，若要用全病毒作為包被抗原進(jìn)行ELISA，就只能通過人工感染家兔并從肝臟分離獲得病毒抗原，這顯然不實用。重組VP60蛋白易獲得，可以作為ELISA的包被抗原檢測抗RHDV抗體，而桿狀病毒系統(tǒng)雖能表達(dá)VP60蛋白，且能夠裝配