山羊副流感病毒3型分離、鑒定及其核衣殼蛋白的原核表達(dá).pdf

1、副流感病毒3型（Parainfluenza virus type3，PIV3）是引起人和動(dòng)物呼吸道疾病的重要病原。主要有牛PIV3(BPIV3)和人PIV3(HPIV3)，BPIV3可引起牛嚴(yán)重的呼吸道疾病，并有較高的發(fā)病率和致死率，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的損失。但PIV3在羊群中的感染情況在國(guó)內(nèi)外都鮮有研究和報(bào)道。2013年下半年起江蘇、安徽多地山羊養(yǎng)殖場(chǎng)育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，臨床表現(xiàn)較以往嚴(yán)重，傳統(tǒng)藥物治療的治愈率低，向

2、我們提示了病原的特殊性。本研究將采集自表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸道癥狀的山羊臨床病料處理后接種MDBK細(xì)胞，連續(xù)傳代分離到病毒，進(jìn)一步通過(guò)病毒蝕斑純化實(shí)驗(yàn)純化病毒，經(jīng)RT-PCR和血凝性鑒定證明病毒分離成功。通過(guò)對(duì)其基因測(cè)序及病原學(xué)特性研究證實(shí)其不同于其他PIV3，是PIV3新成員，將該毒株命名為山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus3，CPIV3）JS2013株。
　　為了進(jìn)一步探究新分離得到的CPIV3

3、 JS2013株的致病性，本試驗(yàn)采用PIV3易感動(dòng)物豚鼠研究此病毒在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制及機(jī)體組織病理?yè)p傷等情況。攻毒后2天攻毒組的豚鼠開(kāi)始出現(xiàn)打噴嚏、流鼻涕、眼分泌物增多及腹式呼吸的臨床癥狀，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)較高的致死率。攻毒后3天可以檢出病毒血癥，持續(xù)到攻毒后第7天，攻毒后第3天開(kāi)始直到第14天均可以從肺組織中檢測(cè)到病毒。剖檢觀察攻毒組豚鼠，豚鼠肺出現(xiàn)實(shí)變、淤血、腫大，病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攻毒組豚鼠肺組織出現(xiàn)肺泡間隔增寬、肺泡融合、炎性細(xì)胞浸

4、潤(rùn)等變化。HI試驗(yàn)表明豚鼠感染后第5天開(kāi)始出現(xiàn)血凝抑制抗體，之后持續(xù)升高至21天仍保持較高的水平。以上結(jié)果表明CPIV3 JS2013株對(duì)豚鼠具有較強(qiáng)的致病性，且豚鼠是一種研究CPIV3較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　以本試驗(yàn)分離的CPIV3 JS2013株純化的第4代病毒液為樣本，提取總RNA，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的各PIV3成員的全基因組序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物擴(kuò)增CPIV3JS2013株N基因的部分片段。將其克隆到pMD18

5、-T載體上，篩選并鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD18-T-N，再將其克隆到原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a(+)上，經(jīng)菌液PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32a-N，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，表明CPIV3 JS2013株N基因獲得高效表達(dá)。Western-blot檢測(cè)表明本試驗(yàn)表達(dá)的重組N蛋白具有良好的反應(yīng)原性。將該蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，IFA檢測(cè)顯示良好的