A型流感病毒誘導外周血單個核細胞凋亡研究.pdf

1、背景及目的：
　　流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,其起病急,蔓延快,對人群尤其是兒童、老年人及免疫缺陷者造成很大的危害。流感病毒點突變造成的抗原漂移可導致流感每年季節(jié)性流行,而基因重配造成的抗原轉換則可能產生新的亞型,因人類對新亞型普遍缺乏免疫力而可能導致流感世界大流行。
　　流感病毒已被證明能誘導各組織細胞的凋亡,包括外周血單個核細胞。已經證明:從小鼠中分離得到的淋巴細胞能被從人身上分離得到的高致病A型流感病

2、毒所誘導,而導致凋亡的發(fā)生,但流感病毒誘導其凋亡的相關免疫病理學機制并沒得到進一步的闡述。研究表明,在病毒感染細胞時,病毒自身蛋白以及細胞分泌的信號分子都參與到這一過程中,比如,FAS-FASL、腫瘤壞死因子(TNF),RNA依賴的蛋白激酶R(PKR),氧化亞氮,轉化生長因子(TGF),有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶。盡管許多蛋白被證明與流感病毒的凋亡有關,但并沒有一個統(tǒng)一的理論來概括各種因素。
　　在許多生理過程中,凋亡都是自

3、發(fā)產生的,比如組織萎縮,免疫系統(tǒng)的發(fā)育等等。同樣的,凋亡在許多傳染性疾病的病理變化過程中也扮演著重要的角色,比如由病毒所引起的感染,盡管有許多的細胞內蛋白牽涉到這一過程,但腫瘤抑制蛋白P53作為一種調節(jié)性蛋白,在腫瘤抑制、凋亡的調控、細胞周期的調節(jié)上都起著重要的作用。P53還是各種外界應急壓力下抑制異常細胞過度生長的主要組分之一。各種細胞外界壓力,包括病毒感染,藥物處理等,均能激活P53的表達,進而導致細胞周期停滯或發(fā)生凋亡。P53的調

4、節(jié)作用主要通過對蛋白磷酸化機制的穩(wěn)定,增強核定位,改變構象,增強 DNA的結合等幾個方面來起作用。
　　本實驗選用各不同健康人的外周血,從中分離得到淋巴細胞和單核巨噬細胞,并用H1N1 A型流感病毒感染,通過流式PI單染色以及Annexin V-PI雙染色檢測并比較外周血淋巴細胞以及單核巨噬細胞在不同情況下的凋亡情況。RT-PCR分別檢測P53,IFN的RNA表達水平。根據(jù)檢測的結果,加入了Pifithrin-α(PFT-α)抑制

5、P53轉錄,檢測P53被抑制時,外周血淋巴細胞以及單核巨噬細胞的凋亡情況。
　　材料與方法：
　　選取由本實驗室提供的A型流感病毒A/Shantou/169/2006(H1N1)1株,選用流感病毒分離鑒定細胞系MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞,通過紅細胞凝集試驗(Hemagglutination assay, HA)、空斑形成試驗(Plaque-forming assay),得到空斑形成單位

6、(Plaque forming unit, PFU)為1.2×107 PFU/ml的病毒液。采集志愿者的新鮮血液并于1h內用Ficoll淋巴細胞分離液分離并得到單個核細胞、淋巴細胞以及單核巨噬細胞。用病毒液吸附不同處理方式的細胞:包括1.病毒直接吸附單個核細胞;2.病毒直接吸附淋巴細胞以及單核巨噬細胞1h后,再將淋巴細胞和單核巨噬細胞進行分離;3.將淋巴細胞,單核巨噬細胞進行分離后再用流感病毒進行吸附;4.病毒吸附不同時間后,淋巴細胞、

7、單核巨噬細胞的凋亡情況?？刂聘腥緩蛿?shù)( Multiplicity of infection, MOI)為2。并使用流式細胞術,通過碘化丙錠(Propiolium, PI)單染色和Annexin V-PI雙染色的方法檢測細胞的凋亡,以確認不同處理間凋亡是否存在差異。同時,提取病毒感染后培養(yǎng)2h,4h,8h,12h淋巴細胞以及單核巨噬細胞的RNA,檢測淋巴細胞,單核巨噬細胞中P53,IFN在RNA表達水平上的差異。根據(jù)PCR結果,使用Pif

8、ithrin-α(PFT-α)抑制P53的轉錄,并通過流式PI單染色檢測淋巴細胞、單核巨噬細胞的凋亡情況。
　　結果：
　　1.所取H1N1 A型流感病毒在MDCK中進行培養(yǎng)后,滴度有所下降,滴度從512下降到培養(yǎng)后的256.
　　2.空斑形成試驗:PFU=1.2×107 PFU/ml
　　3. PI染色結果:淋巴細胞在病毒的作用下凋亡率逐漸增加,但同時隨著淋巴細胞體外培養(yǎng)時間的延長,淋巴細胞自身出現(xiàn)的凋亡也逐漸

9、增加。在24h,加入流感病毒的單核巨噬細胞其凋亡較未加入病毒的對照組要高,而從48h開始,加入病毒的單核巨噬細胞其凋亡則反較對照組要低。Annexin V-PI雙染色結果與PI單染色結果一致。
　　4.將淋巴細胞、單核巨噬細胞用流感病毒吸附1h后再進行分離與淋巴細胞、單核巨噬細胞分離后再進行病毒吸附1h,培養(yǎng)48h后分別進行凋亡檢測,其中淋巴細胞凋亡比例前者較后者要低。
　　5.熒光染色結果:流感病毒分別吸附1h,2h,4h

10、,8h,培養(yǎng)48h后,各凋亡比例間不存在差異。
　　6. RT-PCR結果:淋巴細胞在2h,4h,P53表達水平均升高,對照組在8h,P53仍有少量表達。單核巨噬細胞在4h后,病毒感染組,其P53表達水平要明顯升高。IFN RT-PCR結果無差異。
　　7.加入抑制劑PFT-α后PI染色:淋巴細胞,單核巨噬細胞凋亡峰均消失,凋亡被抑制。
　　結論：
　　1.流感病毒分別感染單個核細胞,淋巴細胞,單核巨噬細胞,其各

11、自的凋亡比例之間的差異顯示了在流感病毒誘導的凋亡中,淋巴細胞與單核巨噬細胞之間是存在相互作用的。
　　2.流感病毒在細胞中吸附不同時間后,檢測細胞凋亡情況,說明凋亡與流感病毒吸附時間的長短不存在相關性。
　　3.流感病毒能夠誘導淋巴細胞凋亡,而對單核巨噬細胞,病毒吸附后,培養(yǎng)48h前表現(xiàn)為誘導凋亡,培養(yǎng)48h后則表現(xiàn)為抑制凋亡,在不同的時間段表現(xiàn)為不同的效果。
　　4.通過對IFN,P53 RNA水平的檢測結果,說明流