銀翹散及其性味分組提取物對流感病毒感染誘導細胞凋亡作用的實驗研究.pdf

1、目的： 依據“性味-功效”相關性理論和醫(yī)家的臨證思維方法，從性味配伍對銀翹散進行拆方研究。通過銀翹散及其性味分組提取物抗Ⅳ感染MDCK細胞、小鼠實驗，從抑制Ⅳ、誘生干擾素、抑制細胞凋亡等角度來探討銀翹散抗Ⅳ主要作用機制、主要生物效應和方中藥物的最佳劑量配比關系，為銀翹散多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點抗Ⅳ作用提供理論支持和實驗依據。 材料與方法： 1.采用乙醇提取方法制備銀翹散及其性味分組提取物。 2.用Ⅳ滴鼻造成

2、小鼠感染模型，以小鼠肺組織中病毒的血凝滴度作為觀察指標，運用正交設計方法，觀察銀翹散各藥物配伍與藥效之間的關系。 3.建立Ⅳ感染細胞模型，通過先感染病毒后給藥、先給藥后感染病毒和藥物病毒同時作用三種給藥方式，采用CPE和MTT法觀察銀翹散及其性味分組提取物對Ⅳ感染MDCK細胞的作用。 4.采用DNA瓊脂糖凝膠電泳和TUNEL法檢測細胞凋亡;通過細胞爬片，采用免疫組化法檢測凋亡細胞Fas/FasL的表達，觀察銀翹散及其性味

3、分組提取物對Ⅳ感染MDCK細胞誘導細胞凋亡的影響。 5.建立小鼠Ⅳ肺炎模型，應用RT-PCR和ELISA法檢測Ⅳ感染量及IFN-γ的含量，結合小鼠一般狀態(tài)、肺組織病理切片、形態(tài)學、肺指數等指標，觀察銀翹散及其性味分組提取物對Ⅳ感染小鼠的作用。 6.采用TUNEL法和免疫組化法觀察小鼠肺組織細胞凋亡及Fas/FasL的表達，觀察銀翹散及其性味分組提取物對Ⅳ感染小鼠誘導細胞凋亡的作用。 結果： 1.通過直觀分

4、析和正交分析，銀翹散必要因素有連翹、金銀花、牛蒡子、荊芥穗、竹葉、生甘草、桔梗、薄荷(P＜0.05)，而淡豆豉的作用不明顯(P＞0.05)。 2.銀翹散及其性味分組對Ⅳ感染具有不同程度的治療作用，銀翹散組作用與藥物濃度呈正向關。銀翹散(1:1～1:4)及清熱解毒(1:1～1:2)組治療效果與病毒唑組比較無顯著性差異(P＞0.05)。銀翹散及其性味分組對Ⅳ具有較好的預防作用，銀翹散(1:1～1:8)、清熱解毒(1:1～1:8)、辛

5、涼解表(1:1～1:4)、辛溫解表(1:1～1:8)組與病毒唑組比較有顯著差異(P＜0.05)，銀翹散、清熱解毒、辛溫解表組作用與藥物濃度呈正向關。銀翹散及其性味分組對Ⅳ具有直接滅殺作用(P＜0.05)，其中銀翹散、清熱解毒組作用與藥物濃度呈正向關。銀翹散(1:1～1:2)、清熱解毒(1:1～1:4)、辛涼解表(1:1)組直接滅殺Ⅳ作用優(yōu)于病毒唑組(P＜0.05)，而辛溫解表組與病毒唑組比較無顯著差異(P＞0.05)。 3.銀翹

6、散及其性味分組和病毒唑組未出現凋亡“梯狀”圖譜，能降低凋亡指數(AI)，減少細胞凋亡，增強Fas的吸光度(P＜0.05)。與病毒唑組相比，銀翹散、清熱解毒組無顯著性差異(P＞0.05)，而辛涼解表、辛溫解表組有顯著性差異(P＜0.05)。與病毒組相比，銀翹散、清熱解毒、辛涼解表組和病毒唑組能升高FasL的吸光度，有顯著性差異(P＜0.05)；與病毒唑組相比，銀翹散、清熱解毒組無顯著性差異(P＞0.05)，而辛涼解表組有顯著性差異(P＜0

7、.05)。 4.小鼠Ⅳ肺炎模型復制：肺組織中檢測到Ⅳ總RNA大量表達，肺指數增高，病理改變呈間質性肺炎病變：肺泡間隔水腫、炎細胞浸潤，肺泡腔內漿液性滲出。 5.小鼠肺組織Ⅳ總RNA的表達：與病毒組比較，銀翹散及其性味分組和病毒唑組均有顯著差異(P＜0.05)，與病毒唑組比較，銀翹散、清熱解毒、辛涼解表組無顯著差異(P＞0.05)，辛溫解表組有顯著差異(P＜0.05)。 6.RT-PCR法測IFN-γ表達：與病毒組

8、比較，銀翹散、清熱解毒、辛溫解表組及病毒唑組有顯著差異(P＜0.05)，辛涼解表組無顯著差異(P＞0.05)；與病毒唑組比較，銀翹散、清熱解毒、辛涼解表組有顯著差異(P＜0.05)，辛溫解表組無顯著差異(P＞0.05)。ELISA法：Ⅳ感染小鼠，其肺組織中的IFN-γ含量明顯增多(P＜0.05)；與病毒組比較，銀翹散、清熱解毒組及病毒唑組有顯著差異(P＜0.05)，辛涼解表、辛溫解表組無顯著差異(P＞0.05)；與病毒唑組比較，銀翹散及

9、其性味分組均有顯著差異(P＜0.05)。 7.Ⅳ感染能夠誘導小鼠肺組織細胞凋亡，Fas及FasL蛋白大量表達(P＜0.05)，銀翹散組、清熱解毒組能夠降低凋亡指數(AI)，抑制Ⅳ感染誘導小鼠肺組織的細胞凋亡(P＜0.05)，同時能下調肺組織中Fas/FasL蛋白表達(P＜0.05)。與病毒唑組FasL相比，銀翹散組無顯著性差異(P＞0.05)，清熱解毒組有顯著性差異(P＜0.05)。辛涼解表、辛溫解表組，與病毒組AI比較，無顯著

10、差異(P＞0.05)；與病毒唑組Fas相比，有顯著性差異(P＜0.05)；與正常組FasL比較，無顯著性差異(P＞0.05)。 結論： 1.從降低Ⅳ滴鼻感染小鼠肺組織勻漿血凝滴度的角度看，銀翹散以連翹2金銀花2牛蒡子2荊芥穗。竹葉2生甘草2桔梗1薄荷2淡豆豉1治療效果好。 2.銀翹散及其性味分組對Ⅳ感染MDCK細胞具有預防、治療和直接滅殺作用。辛溫解表組對銀翹散直接滅殺Ⅳ作用的貢獻率不如其它二組。在不同的給藥方式

11、中，“先用藥后感染病毒”抑制病毒作用效果最好。 3.Ⅳ感染MDCK細胞能夠誘導細胞凋亡。銀翹散及其性味分組能夠抑制Ⅳ誘導MDCK細胞凋亡，其作用機制可能是通過Fas/FasL途徑來實現，其中清熱解毒組起了主要作用。 4.銀翹散具有直接抑制Ⅳ、減少肺病理損傷和誘生干擾素作用，前二者是清熱解毒組、辛涼解表組、辛溫解表組三合方“整合”的結果，后者主要是通過清熱解毒組而奏效。 5.Ⅳ感染能夠誘導小鼠肺組織發(fā)生細胞凋亡。銀