異型流感病毒感染交叉保護作用研究.pdf

1、流行性感冒(Influenza，簡稱流感)是由流行性感冒病毒(Influenza virus，簡稱流感病毒)引起的急性呼吸道病，潛伏期短、發(fā)病率高、傳染性強、傳播快，對人類健康威脅極大。流感病毒核酸為分節(jié)段單鏈負股RNA，通常分8個片段。根據(jù)NP和M抗原的不同，流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，又可根據(jù)HA和NA抗原的差別分為不同亞型。甲型流感病毒(InfluenzaAvirus，IAV)有17個HA亞型和10個NA亞型。流感

2、病毒基因組中突變率最高的是HA基因，其次是NA基因。其變異機理涉及分子水平的抗原漂移(antigenic drift)和抗原轉(zhuǎn)換(antigenic shift)。
　　由于流感病毒易變異，且流感至今尚無特效治療方法，因此流感的預(yù)防顯得尤為重要。接種疫苗是預(yù)防流感最有效的手段。現(xiàn)有疫苗都是株特異性的，通過體液免疫產(chǎn)生的中和抗體對抗病毒感染，疫苗所含的抗原必須和流行株抗原有較高的相似性才能起到保護作用。異型流感病毒感染時，疫苗的保護

3、作用受到限制。因此，“普遍的”、“通用型”疫苗成為科學(xué)家關(guān)注的焦點。近幾十年來，眾多學(xué)者利用各種甲型流感病毒共有抗原成分，如NP或M，制備疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)可以在異型流感病毒間發(fā)生部分交叉免疫。另外，流感病毒疫苗和佐劑連接疫苗亦存在部分異型株間交叉免疫保護作用。研究表明，流感病毒特異性抗體，往往由流感病毒表面蛋白HA抗原刺激產(chǎn)生，特異性強，不能中和異型流感病毒;而上述流感病毒共有抗原產(chǎn)生的抗體，抗體滴度低或為非中和抗體，達不到阻止異型流

4、感病毒感染的目的。特異性細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)在抗異型流感病毒感染中的作用，尚無統(tǒng)一結(jié)論，仍需進一步研究。
　　為了解H5亞型和H1亞型間的交叉保護作用，我們選擇了H5亞型流感疫苗免疫小鼠，H1亞型流感病毒感染小鼠，發(fā)現(xiàn)H5亞型和H1亞型間存在交叉保護作用，且異型流感病毒感染小鼠肺中IFN-γ水平明顯增高?；谶@一結(jié)果，在后續(xù)的實驗中，以IFN-γ為中心，研究在異型流感病毒感染過程中與其相關(guān)的免疫分子及細胞的變化情況。IFN-γ既可以阻

5、止病毒在體內(nèi)的復(fù)制、擴散，又能對多種免疫細胞發(fā)揮強大的調(diào)節(jié)作用，在抗流感病毒感染的過程中同樣發(fā)揮重要作用。那么與IFN-γ相關(guān)的其他細胞因子表達水平如何？它們在異型流感病毒感染中發(fā)揮作用如何？肺泡巨噬細胞(Pulmonary alveolar macrophage，PAM)作為重要的抗原提呈細胞(Antigen presenting cells，APC)，其表面分子的表達可能會影響流感病毒異型免疫（Heterosubtypic immu

6、nity，HSI）的能力。這些表面分子在流感病毒的HSI中表達水平升高還是降低？是增強免疫還是抑制免疫？這些問題有待于進一步深入研究。
　　IFN-γ可以促使CD8+T細胞成熟為效應(yīng)CTL細胞;活化巨噬細胞，提高其吞噬能力;激活NK細胞，增強其清除感染細胞的能力。T細胞是介導(dǎo)細胞免疫的主要細胞。在異型流感病毒感染的過程中，T細胞的增殖活性如何？執(zhí)行細胞免疫功能的、有活性的T細胞水平如何？巨噬細胞和NK細胞是執(zhí)行免疫應(yīng)答的一種重要細

7、胞，具有抗原加工、提呈和免疫調(diào)節(jié)等作用。巨噬細胞和NK細胞雖然是固有免疫中重要的免疫細胞，但它們也是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁。在流感病毒的HSI中，巨噬細胞和NK細胞發(fā)揮怎樣的作用？其殺傷能力如何？
　　為回答上述問題，我們擬對小鼠進行H5亞型流感病毒免疫、H1流感病毒感染，特別采用免疫佐劑IL-2加強免疫，通過對比分析各組小鼠主要免疫分子水平及免疫細胞功能變化的特點，以期確定異型流感病毒交叉保護作用的主要效應(yīng)機制，及與IF

8、N-γ相關(guān)的免疫分子、免疫細胞的水平、活性，為流感的預(yù)防和有效控制提供新的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　一、實驗材料
　　1、流感病毒A/H1N1;rL H5流感重組活疫苗、A/H5N1流感滅活疫苗;2、6-8周齡雌性C57BL/6小鼠;
　　3、細胞因子檢測試劑盒;
　　4、RNA提取相關(guān)試劑，RT試劑盒，Real-time PCR相關(guān)試劑;
　　5、MTT檢測試劑盒;
　　6、流式細胞術(shù)

9、檢測相關(guān)抗體及試劑;
　　7、NO檢測相關(guān)試劑等。
　　二、實驗方法
　　1、C57BL/6小鼠(6-8周，雌性)隨機分組:異型免疫組，異型免疫加強組，同型組，PBS對照組，IL-2對照組。分別用流感疫苗、A/H1N1病毒和PBS免疫小鼠兩次，用A/H1N1流感病毒感染。在感染前(0d)和感染后4d、7d處死小鼠，收集肺泡灌洗液，肺、脾組織，血液等樣品。
　　2、記錄小鼠肺重、體重和死亡情況，計算肺指數(shù)和生存率。

10、
　　3、ELISA方法測定肺中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平，流式細胞術(shù)測定CD4+T、CD8+T細胞水平。
　　4、Real-time PCR方法測定肺內(nèi)病毒量。
　　5、血清中H1N1抗體水平測定。
　　6、PAM表面MHCⅠ、MHCⅡ和TLR7測定。
　　7、細胞因子IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α的測定。
　　8、T細胞增殖活性測定及IFN-γ+CD4+T和IF

11、N-γ+ CD8+T細胞水平測定。
　　9、巨噬細胞釋放NO能力的測定。
　　10、CD49b+ NKG2D+ NK細胞水平測定。
　　11、使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±s）表示，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異;當有統(tǒng)計學(xué)意義時，用SNK法進行組間比較，p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、流感病毒異型免疫組和異型免疫加強組與PBS組相比

12、，小鼠生存率升高、肺指數(shù)、肺病毒載量降低;異型免疫組和異型免疫加強組肺內(nèi)的IL-10和IFN-γ的含量、脾中CD4+T和CD8+T細胞水平顯著高于同型免疫組和感染前。除同型對照組外，其他各組未有H1N1抗體檢出。
　　2、流感病毒異型免疫組和異型免疫加強組小鼠PAM表面的MHCⅠ的表達水平顯著高于感染前和同型免疫組，且異型免疫加強組高于異型免疫組。其他表面分子未見顯著變化。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠肺中細胞因子IL-6、IL-

13、18和TNF-α的水平分別顯著高于PBS組和單純使用IL-2組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠肺中細胞因子IL-6、IL-18和TNF-α的水平顯著高于同型免疫組。IL-12的含量未見顯著變化。
　　3、流感病毒異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中T細胞的增殖活性顯著高于PBS組和感染前。感染后7d異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+ CD8+T細胞的含量顯著高于感染前和同型免疫組。異型免疫加強

14、組小鼠脾臟中IFN-γ+ CD4+T和IFN-γ+CD8+T細胞的含量顯著高于單純使用IL-2組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中巨噬細胞釋放的NO水平顯著高于同型免疫組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中巨噬細胞釋放的NO水平分別顯著高于PBS組和單純使用IL-2組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾中CD49b+ NKG2D+ NK細胞水平顯著高于同型免疫組和PBS組。
　　結(jié)論：
　　1、流感病毒H5亞型與H1亞型

15、間存在交叉免疫保護作用。
　　2、在流感病毒的HSI中，抗體的保護作用不大，細胞免疫保護作用明顯。T細胞增殖能力顯著增強，IFN-γ+CD4+T細胞和IFN-γ+CD8+T細胞含量顯著增加。異型流感病毒感染后肺中IFN-γ水平升高，巨噬細胞分泌IFN-γ相關(guān)細胞因子IL-6、IL-18和TNF-α水平升高，共同發(fā)揮抗病毒感染的功能。巨噬細胞、NK細胞活性增強。
　　3、PAM表面分子MHC-Ⅰ表達顯著升高，在流感病毒HSI中