流感病毒感染與粘膜免疫損傷.pdf

1、在機體的正常生理活動中，肺臟的主要功能是負責機體與外界環(huán)境的氣體交換。肺臟的這種特殊生理功能決定其成為一個對外開放的器官，這就使得肺臟時刻接受來自外界環(huán)境中非己物質以及各種微生物的刺激。然而，令人驚訝的是，盡管呼吸道擁有巨大的表面并且每天有大量的感染因子伴隨空氣進入呼吸道，但是呼吸道炎癥反應卻很少發(fā)生。
　　 人的上呼吸道同腸道一樣，有大量共生菌的寄居，宿主與共生菌之間的相互作用往往是互惠互利的。已有研究發(fā)現，腸道共生菌在腸道免

2、疫系統(tǒng)的形成以及腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持中都發(fā)揮著重要的作用。腸道共生菌的組份能夠刺激腸道上皮細胞表達的Toll樣受體從而保護腸道上皮組織抵抗有害病原體的感染。呼吸道共生菌是否也具有與腸道共生菌相似的功能，能夠保護呼吸道抵抗有害病原體的感染和維持呼吸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)昵？這是本論文的研究目的之一。
　　 在正常狀態(tài)下，呼吸道免疫系統(tǒng)受到免疫負向調節(jié)機制的嚴格控制以防止有害炎癥反應的發(fā)生。然而，當外來病原體在呼吸道中建立有效感染時，呼吸道

3、免疫系統(tǒng)會被快速激活從而對病原體進行清除。然而，過度的免疫應答在清除病原體的同時會導致機體組織發(fā)生免疫病理損傷甚至死亡。流行性感冒，簡稱流感，是一種由流感病毒引起的呼吸道感染疾病，在世界各地經常會有區(qū)域性和季節(jié)性的大流行。據統(tǒng)計，全世界每年有300到500萬人因流感死亡。研究發(fā)現，過度免疫應答導致的病理損傷是流感病毒感染導致宿主死亡的重要原因。
　　 在臨床上，流感除有咳嗽、發(fā)熱、頭疼等主要癥狀外，還會引發(fā)腹痛，惡心，嘔吐和腹瀉

4、等類似腸胃炎的并發(fā)癥，在兒童中更甚。盡管在許多流感病人中都發(fā)現有這些類似胃腸炎的癥狀，但其免疫學機制尚不清楚，這是本論文的另一個研究目的。
　　 在本論文中，我們取得了兩部分的結果：Ⅰ、呼吸道共生菌抑制流感病毒感染誘導的致死炎癥；Ⅱ、呼吸道流感病毒感染誘導Th17細胞依賴的小腸免疫損傷。
　　 Ⅰ、呼吸道共生菌抑制流感病毒感染誘導的致死炎癥
　　 在本部分中，采用金黃色葡萄球菌（S.aureus）滴鼻致敏小鼠建立

5、S.aureus上呼吸道共生模型，之后利用該模型探討了呼吸道共生菌對流感病毒感染的影響。通過給小鼠滴鼻接種流感病毒PR8建立感染模型；利用H&E染色的方法檢測肺臟的病理損傷；通過ELISA的方法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子的水平；通過RT-PCR的方法檢測小鼠肺臟中PR8的滴度；利用流式細胞術和RT-PCR的方法檢測肺泡巨噬細胞中M2型巨噬細胞相關標志的表達；利用體內細胞轉輸和體外增殖抑制實驗驗證M2型巨噬細胞的功能：通過

6、上述一系列的研究方法，我們取得了如下實驗結果：
　　 1、S.aureus預先致敏保護小鼠抵抗流感病毒導致的死亡
　　 我們采用1X107CFU的S.aureus滴鼻處理小鼠建立S.aureus小鼠上呼吸道共生模型。之后，我們給小鼠滴鼻感染致死劑量的流感病毒PR8，發(fā)現S.aureus預先致敏可以保護小鼠抵抗PR8感染導致的死亡，并且這種抵抗死亡的機制是通過減輕PR8感染所誘導的免疫損傷實現的。
　　 2、S.a

7、ureus致敏誘導的保護作用依賴于TLR2的活化
　　 在Tlr2-/-小鼠中，S.aureus預先致敏不能保護小鼠抵抗PR8感染導致的死亡。通過進一步免疫病理分析和細胞因子檢測，我們發(fā)現在Tlr2-/-小鼠中，S.aureus預先致敏不能減輕PR8感染所誘導的免疫損傷。因此，S.aureus致敏介導的保護作用依賴于TLR2的活化。
　　 3、S.aureus致敏誘導的保護作用不依賴于病毒滴度的降低
　　 通過比

8、較對照小鼠與S.aureus致敏小鼠在PR8感染過程中肺臟中的病毒滴度，我們發(fā)現S.aureus致敏能夠降低PR8感染過程中小鼠肺臟中的病毒滴度。進而，發(fā)現S.aureus致敏的WT小鼠和S.aureus致敏的Tlr2-/-小鼠肺臟中的病毒滴度沒有顯著性的差異。因此，S.aureus致敏誘導的保護作用并不依賴于抑制病毒的增殖。
　　 4、S.aureus致敏誘導的保護作用依賴于肺泡巨噬細胞(AMs)
　　 S.aureu

9、s致敏能顯著提高AMs的數目和AMs表面TLR2的表達。采用CL2MDP-lip清除AMs，發(fā)現在清除AMs的小鼠中S.aureus預先致敏不能保護PR8導致的死亡。通過轉輸實驗，我們發(fā)現S.aureus致敏來源的AMs能夠恢復AMs清除小鼠抵抗PR8導致的死亡的能力。因此，S.aureus致敏誘導的保護作用是AMs依賴的。
　　 5、TLR2活化營造的肺泡環(huán)境促進AMs向M2型巨噬細胞極化
　　 我們發(fā)現S.aureu

10、s致敏能夠顯著提高M2型巨噬細胞相關標志Argl，Fizzl，IL-10和TGF-β在AMs中的表達。S.aureus致敏能夠誘導WT小鼠BALF中IL-13的水平顯著升高，而Tlr2-/-小鼠中則沒有。因此，TLR2活化營造的肺泡環(huán)境有助于AMs向M2型巨噬細胞極化。
　　 6、M2型巨噬細胞抑制PR8感染過程中炎癥細胞的招募和增殖
　　 通過對PR8感染后BALF中的炎癥細胞進行分析，我們發(fā)現S.aureus致敏能夠

11、顯著降低BALF中NK細胞，中性粒細胞以及T細胞等炎癥細胞的數目。通過體外實驗，發(fā)現S.aureus致敏小鼠來源的AMs能夠顯著地抑制ConA誘導的T細胞的增殖。
　　 綜上所述，本研究通過建立S.aureus小鼠上呼吸道共生模型，發(fā)現S.aureus致敏能夠保護小鼠抵抗PR8感染導致的死亡，這種保護作用依賴于減輕PR8感染誘導的免疫損傷而并不依賴于抑制病毒的增殖。在S.aureus致敏過程中，TLR2活化所營造的肺泡環(huán)境能夠促

12、進AMs向M2型巨噬細胞極化，進而抑制PR8感染過程中炎癥細胞的招募和增殖。
　　 Ⅱ、呼吸道流感病毒感染誘導Th17細胞依賴的小腸免疫損傷
　　 在本部分中，通過給小鼠滴鼻接種流感病毒PR8建立感染模型；利用H&E染色的方法檢測組織的病理損傷；通過血清中ALT和BUN水平判斷肝臟和腎臟的功能是否正常；通過CBA的方法檢測血清中細胞因子的水平；通過PCR的方法檢測組織中流感病毒是否存在：利用流式細胞術檢測Th17細胞；利

13、用RT-PCR的方法檢測小腸中IL-17A，IFN-γ，IL-6，TGF-β和CCL25的表達；利用抗生素清除小鼠腸道共生菌；利用中和抗體阻斷體內IL-17A和CCL25的作用。通過上述一系列的研究方法，我們取得了如下實驗結果：
　　 1、流感病毒感染誘導小腸免疫損傷
　　 在小鼠呼吸道流感病毒感染模型中，我們發(fā)現PR8感染在引起肺臟免疫損傷的同時還會引起小腸免疫損傷，而不會引起肝臟和腎臟的損傷。在肺臟中能夠檢測到流感病

14、毒的存在而在小腸中卻檢測不到。因此，流感病毒呼吸道感染能夠誘導小腸免疫損傷，并且這種損傷不是由病毒直接感染所致。
　　 2、流感病毒感染誘導小腸中Th17細胞富集
　　 通過小腸組織基因芯片分析，我們發(fā)現PR8感染后小腸中RORγt的表達水平升高。進而，我們發(fā)現伴隨著PR8感染，小腸上皮內淋巴細胞(IEL)和固有層內淋巴細胞(LPL)中CD4+T細胞和Th17細胞逐漸增多，但在腸系膜淋巴結，縱膈淋巴結和外周血中卻沒有檢測

15、到Th17細胞的存在。同時，PR8感染會上調小腸組織中IL-17A的表達而下調IFN-γ的表達。抗體中和IL-17A能夠抑制PR8誘導的小腸免疫損傷。因此，流感病毒感染引起的小腸免疫損傷是Th17細胞依賴的。
　　 3、腸道共生菌的清除減輕流感病毒感染誘導小腸免疫損傷
　　 通過檢測，我們發(fā)現PR8感染后腸道中總細菌數沒有發(fā)生改變。利用抗生素清除腸道共生菌后，PR8的感染不能誘導小腸免疫損傷發(fā)生，同時，在小腸IEL和LP

16、L中Th17細胞也不存在了。因此，腸道共生菌參與PR8感染誘導的小腸免疫損傷。
　　 4、腸道共生菌促進CD4+T細胞的招募和Th17細胞的極化
　　 通過小腸組織基因芯片分析，我們發(fā)現PR8感染能夠上調小腸中CCL25的表達。同時，我們發(fā)現PR8感染后縱膈淋巴結和小腸中CCR9+CD4+T細胞的數目都明顯增加了。進而，我們發(fā)現腸道共生菌的清除會降低IL-6，TGF-β和CCL25在小腸中的表達。因此，腸道共生菌可能通過