流感病毒血凝素基因抗流感病毒感染關(guān)鍵序列解析及嵌合基因疫苗的研究.pdf

1、(一)B型流感病毒血凝素基因抗同型流感病毒感染關(guān)鍵序列解析 血凝素(HA)是B型流感病毒主要的表面糖蛋白。B/Ibaraki/2/85 HA基因全長1758bp，包括信號肽序列、HA1和HA2序列。我們以前的研究表明B/Ibaraki/2/85 HA-DNA在小鼠模型上誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可以對同型病毒的攻擊提供完全保護。本研究通過PCR的方法構(gòu)建一系列從B/Ibaraki/2/85 HA基因的3’端或5’端連續(xù)缺失的裁短HA質(zhì)粒，用

2、這些質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，并以致死量的同型病毒攻擊小鼠，通過觀察小鼠的存活率、體重丟失率、血清中HA抗體的效價和肺部病毒量來尋找HA DNA抗流感病毒的關(guān)鍵序列。實驗結(jié)果表明，HADNA從3’端連續(xù)缺失885個核苷酸(295個氨基酸)或5’端信號肽部分連續(xù)缺失9個核苷酸，HA-DNA失去保護作用。保留HA的信號肽，HA DNA從5’端連續(xù)缺失51個核苷酸(17個氨基酸)，HA-DNA失去保護作用。隨著HA DNA從3’端或5’端連續(xù)

3、缺失的核苷酸數(shù)目增多，HA-DNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價下降。B型流感病毒HA DNA的nt94-nt876片段在HA DNA疫苗抗同型流感病毒感染中起重要作用。 (二)A、B型流感病毒嵌合基因疫苗的構(gòu)建及免疫保護研究 本研究在證實A型和B型流感病毒HAl DNA及關(guān)鍵序列DNA能提供抗同型流感病毒保護的基礎(chǔ)上，將編碼A型和B型HA1或關(guān)鍵序列基因(A/PR/8/34HA基因ntl-826，B/Ibaraki/2/85 HA

4、基因ntl-876)構(gòu)建在同一質(zhì)粒中，制備成嵌合DNA疫苗。將這些重組質(zhì)粒免疫小鼠，二免后一周，用致死量流感病毒A/PR/8/34或B/Ibaraki/2/85攻擊，通過測定小鼠血清抗HA抗體和保護效果(包括小鼠的體重丟失率、存活率和肺部病毒量)來評價DNA疫苗的免疫效果。結(jié)果表明：A、B型流感病毒HA1基因嵌合疫苗、關(guān)鍵序列基因嵌合疫苗都能抗兩種流感病毒致死量的攻擊，具有交叉保護的能力。 (三)H5N1型流感病毒血凝素基因抗致

5、死量同型流感病毒感染關(guān)鍵序列解析 通過禽流感病毒A/Chicken/JiangSu/01/2002(H5N1)肺對肺感染BALB/c雌性小鼠，多次傳代使小鼠致死，建立了小鼠感染模型。以H5N1小鼠適應(yīng)株HA-DNA免疫小鼠，探討HA-DNA疫苗和滅活疫苗混合免疫、單獨免疫抗同型流感病毒感染的保護效果。結(jié)果表明，H5N1 HA-DNA能提供抗致死量同型流感病毒的攻擊作用，其保護效果與滅活疫苗無顯著差異。在此基礎(chǔ)上，我們用PCR的方

6、法構(gòu)建了一系列裁短質(zhì)粒，包括3’端連續(xù)缺失的裁短質(zhì)粒和5’端保留信號肽序列的裁短質(zhì)粒。用這些質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，并以致死量同型病毒攻擊。通過觀察小鼠的存活率、體重丟失率、血清中HA抗體的效價和肺部病毒量來尋找H5 HA基因抗流感病毒感染的關(guān)鍵序列。結(jié)果顯示，HA DNA從3’端連續(xù)缺失849個核苷酸(283個氨基酸)或保留HA的信號肽，HA DNA從5’端連續(xù)缺失81個核苷酸(27個氨基酸)，HA-DNA失去保護作用。H5N1鼠適