NP突變體抑制流感病毒復制的機制及形成流感病毒病毒樣顆粒的關鍵蛋白.pdf

1、流感病毒危害嚴重，不僅感染人和多種動物，而且可以引起人和動物發(fā)病死亡，因而容易引發(fā)巨大的經(jīng)濟和社會問題。深入了解病毒的生物學特性及其蛋白間的相互作用機理，研制廣譜高效的抗流感藥物及研發(fā)新型流感疫苗一直是流感病毒研究中的熱點問題。
　　在流感病毒的蛋白中，核衣殼蛋白是流感病毒的主要結(jié)構蛋白，在病毒復制周期中發(fā)揮著重要的作用。由于NP蛋白非常保守，因此非常適合作為廣譜抗流感藥物設計的靶標蛋白。
　　本文從可抑制野生 NP蛋白功能

2、的NP蛋白突變體（NPA387R）入手，利用表達熒光素酶流感病毒微復制系統(tǒng)，通過對 NPA387R進行定點突變以及部分刪除突變，發(fā)現(xiàn)這些突變體在微復制系統(tǒng)中均喪失了轉(zhuǎn)錄活性，刪除 NPA387R上第一個核定位信號不影響突變體抑制野生NP的功能，但是同時刪除NPA387R上兩個核定位信號后突變體喪失了抑制野生 NP的功能。為了確定核定為信號是否決定突變體對野生 NP的抑制功能，我們在刪除第一個核定位信號基礎上，將第二個核定位信號進行了突變

3、，發(fā)現(xiàn)該突變體仍然可以抑制野生NP的功能。
　　進一步我們建立了穩(wěn)定表達 NP突變體（NPA387R）的細胞系和穩(wěn)定表達刪除第一個核定位信號和突變第二個核定位信號突變體的細胞系，通過免疫共聚焦實驗證明 NP突變體（NPA387R）由于保留了核定位信號，主要定位于細胞核；而突變核定位信號的NP突變體主要分布在細胞質(zhì)中。這兩個細胞系均不再支持PR8病毒的生長，表明突變體NP同樣可以抑制流感病毒的復制。
　　突變體 NP是如何導致

4、野生 NP不能行使正常功能呢？為回答這一問題，我們采用免疫共沉淀（Co-IP）、蔗糖梯度密度離心和Western blot等方法分析NP-NP相互作用，實驗結(jié)果顯示，野生 NP之間可以相互作用形成的復合體主要分布在蔗糖梯度的下層，而NP突變體與BSA一樣主要以低聚體形式存在，分布在蔗糖梯度的上層。當突變體與野生 NP作用后在蔗糖中的分布發(fā)生了改變，野生 NP的分布向蔗糖梯度的上層移動，而突變體NP向蔗糖梯度的下層移動，表明突變體與野生N

5、P之間相互作用過程中，突變體 NP參與到野生 NP的多聚體中。結(jié)合突變體的細胞定位，表明 NP與 NP的作用是在未進入細胞核之前就已經(jīng)發(fā)生，通過相互作用，突變體影響野生NP形成正常的RNPs，從而喪失聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性。這一重要的發(fā)現(xiàn)為研制抗流感藥物提出了新的思路，即抑制 NP功能的抗流感藥物在細胞質(zhì)中即可發(fā)揮作用。
　　此外，采用同時表達多個基因的真核表達系統(tǒng)研究影響流感病毒病毒樣顆粒包裝及釋放的主要結(jié)構蛋白。實驗中構建了同時表達

6、HA、NA和M1，HA和NA以及只表達 HA的真核表達質(zhì)粒，將這些表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，表達三個基因以及表達兩個基因的轉(zhuǎn)染細胞上清均有血凝活性，最高效價達到24，而只表達 HA基因的細胞上清沒有血凝活性。將這些上清超速離心，在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)表達三個基因和表達兩個基因的樣品中均有病毒樣顆粒存在，而單獨表達HA的樣品沒有發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒。說明表達HA、NA蛋白就可以包裝并釋放病毒樣顆粒，而M1蛋白對流感病毒病毒樣顆粒的包裝和釋