宿主miRNA抑制A型流感病毒復(fù)制的作用研究.pdf

1、A型流感病毒屬于正粘病毒科,單股負(fù)鏈的RNA病毒。由于其宿主廣泛、傳染性強(qiáng)、傳播速度快,短時(shí)間內(nèi)可造成局部地區(qū)的爆發(fā)或全球范圍的流行。自19世紀(jì)以來,已爆發(fā)四次全球性的流感大流行,其中1918年爆發(fā)的“西班牙流感H1N1”大流行最為嚴(yán)重,造成全世界近5000萬人死亡,給人類健康和全球經(jīng)濟(jì)帶來了極大的危害。目前,針對A型流感病毒感染的預(yù)防和治療措施主要是采用離子通道阻斷劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑等抗病毒藥物,但是這些藥物對于人體神經(jīng)系統(tǒng)均有一定

2、的副作用,而且由于A型流感病毒基因變異快,隨著藥物的大量使用,極易產(chǎn)生耐藥性毒株。因此,進(jìn)行流感病毒治療藥物及抗病毒靶標(biāo)研究迫在眉睫。
　　微小RNA(miRNA)是長度約22nt的非編碼單鏈小RNA分子,廣泛存在于真核生物基因組中,其基因位置及序列都十分保守。miRNA主要通過互補(bǔ)結(jié)合到靶標(biāo)mRNA上而起到轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的作用,參與許多細(xì)胞過程,包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤形成等。目前,已有研究表明宿主miRNA在乙肝病毒

3、、丙肝病毒及人類免疫缺陷病毒等多種病毒感染中通過對宿主或病毒的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,從而影響病毒復(fù)制、侵染及致病等過程。此外,由于miRNA的作用途徑專一且效果明顯,miRNA及其靶點(diǎn)已成為治療病毒性疾病特效基因藥物的研究熱點(diǎn)。
　　A型流感病毒基因組由8個(gè)節(jié)段組成,前三個(gè)節(jié)段編碼聚合酶蛋白PB2、PB1和PA,三者共同組成RNA依賴的RNA聚合酶蛋白復(fù)合體。第五個(gè)節(jié)段編碼核蛋白NP,包裹著病毒的核酸,起保護(hù)作用。在流感病毒復(fù)制過程中

4、NP、病毒RNA及三個(gè)聚合酶蛋白共同組成核糖核蛋白復(fù)合體(RNPs),不僅參與病毒基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯,還在病毒RNA及蛋白的入核、出核及胞質(zhì)聚集過程中發(fā)揮著重要的功能。這四個(gè)基因節(jié)段不僅功能重要,而且存在很多保守位點(diǎn),因此針對以上基因?qū)ふ倚碌乃幬锇形?研制穩(wěn)定的抗流感病毒藥物具有舉足輕重的作用。本研究以流感病毒聚合酶蛋白基因和核蛋白基因?yàn)榘悬c(diǎn),尋找廣譜調(diào)控A型流感病毒復(fù)制的宿主miRNA并確定miRNA的靶位點(diǎn),為宿主抗病毒防御機(jī)制提供更

5、深層次的理解,也為應(yīng)用生物信息學(xué)方法來開發(fā)廣譜抗流感病毒的基因藥物及尋找新抗病毒靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究首先利用生物信息學(xué)方法預(yù)測并篩選廣譜靶向A型流感病毒復(fù)制相關(guān)基因的宿主miRNA。我們以miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件miRanda為主體,設(shè)計(jì)了廣譜靶向A型流感病毒基因的宿主miRNA的預(yù)測篩選流程。采用Perl語言編程從miRanda軟件輸出結(jié)果中提取有用信息,并通過設(shè)定嚴(yán)格的軟件參數(shù),制定詳盡的篩選原則,使篩選出的miRNA兼具

6、廣譜靶向率高與抑制病毒復(fù)制效果好等優(yōu)點(diǎn)。針對PB2基因,挑選了miR-188-3p和miR-345;針對PB1基因,挑選了miR-3183;針對PA基因,挑選了miR-15a*和miR-99b*;針對NP基因,挑選了miR-769-3p;篩選的6個(gè)miRNA對A型流感病毒的廣譜靶向率分別為81.3％,95%,78.7%,83.1%,64.4%和95.3%。
　　隨后從季節(jié)性流感病毒A/FM/1/47(H1N1)毒株中擴(kuò)增PB1、P

7、B2、PA及NP基因全長并構(gòu)入T載體中,通過測序獲得了該毒株的基因序列,miRanda軟件預(yù)測結(jié)果顯示所篩選的6個(gè)miRNA在該毒株上均具有良好的靶向性,堿基對匹配結(jié)合模式具有代表性,可以利用該毒株進(jìn)行miRNA的功能驗(yàn)證。
　　采用一系列實(shí)驗(yàn)方法逐步驗(yàn)證miRNA抑制A型流感病毒復(fù)制的效果。
　　1.首先采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行初步篩選,根據(jù)miRNA的熒光抑制率判定miRNA與潛在靶標(biāo)的結(jié)合能力。結(jié)果顯示生物信息學(xué)

8、篩選出的6條miRNA與潛在靶標(biāo)均有一定的結(jié)合能力,但是靶向于PA基因的miR-15a*和miR-99b*熒光抑制率較小,僅為28.82%和20.75%;其余4條miRNA與潛在靶標(biāo)結(jié)合能力較強(qiáng):miR-188-3p和miR-345可靶向結(jié)合PB2基因,miR-3183可靶向結(jié)合PB1基因,三者熒光抑制率均達(dá)到45%左右。miR-769-3p可靶向結(jié)合NP基因,熒光抑制率為36.5%。
　　2.進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對A型流感病毒蛋

9、白表達(dá)的影響。首先構(gòu)建了表達(dá)PB1、PB2、PA及NP蛋白基因的真核表達(dá)載體,并與人工合成的miRNA模擬物共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。Western印跡結(jié)果顯示4條miRNA均可顯著抑制相應(yīng)病毒蛋白的表達(dá)。其中miR-769-3p對NP蛋白表達(dá)的抑制效果最為顯著。miR-188-3p和miR-345對PB2蛋白表達(dá)的抑制效果、miR-3183對PB1蛋白表達(dá)的抑制效果與陽性對照miRNA(miR-491)對靶標(biāo)蛋白PB1蛋白表達(dá)的抑制效

10、果基本一致。
　　3.最后,觀察miRNA對A型流感病毒復(fù)制的抑制效果。首先驗(yàn)證了季節(jié)性流感病毒A/FM/1/47(H1N1)毒株在MDCK細(xì)胞系及A549細(xì)胞系上的復(fù)制動力學(xué)特性,繪制了一步生長曲線,確定了病毒最佳接毒劑量,隨后利用最佳病毒感染劑量進(jìn)行了miRNA抑制流感病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-188-3p可顯著抑制A型流感病毒在A549細(xì)胞上的復(fù)制,與對照組相比,病毒感染后48h病毒滴度降低0.8個(gè)TCID50。mi

11、R-345效果其次,可使病毒感染后48h病毒滴度降低0.51個(gè)TCID50。二者均優(yōu)于陽性對照miR-491,其僅使病毒感染后48h病毒滴度降低0.43個(gè)TCID50。
　　基于以上研究,我們通過生物信息學(xué)預(yù)測及一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最終篩選到一個(gè)miRNA,即miR-188-3p,可廣譜靶向結(jié)合A型流感病毒PB2基因,抑制PB2蛋白表達(dá),顯著抑制A型流感病毒的復(fù)制。不僅如此,我們通過生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)miR-188-3p對近期爆發(fā)的