銀翹散對呼吸道合胞病毒感染小鼠呼吸系統(tǒng)模型的作用研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是世界范圍的一個主要公共健康問題。RSV感染是導(dǎo)致嬰幼兒下呼吸道感染、細支氣管炎和肺炎的最主要的病原體，也是世界范圍內(nèi)兒童流行性呼吸道疾病的主要感染因素之一。
　　RSV感染目前仍沒有令人信服的安全的針對該病毒的疫苗，也沒有行之有效的抗病毒治療手段。目前可供臨床選用治療RSV的藥物較少，一直以來，西藥方面治療RSV感染的藥物主要有抗病毒藥物、支氣管擴張

2、劑、激素類抗炎藥和免疫調(diào)節(jié)劑等。但是這些藥物都存在比較嚴(yán)重的毒副作用，而疫苗又難以奏效。與西藥相比，中藥的毒副作用小，藥源豐富，防治RSV感染具有的獨特效果。中藥防治RSV感染的優(yōu)勢在于通過調(diào)整機體的免疫狀態(tài)，來增強機體抵抗流感病毒的免疫力。因此，在中醫(yī)藥寶庫中尋找有效防止RSV感染的藥物就成為一項有重大意義的工作。
　　銀翹散為中藥復(fù)方，是中醫(yī)辛涼解表法的代表方，是臨床辨證治療風(fēng)熱型流感的主要方劑;對流行性感冒、肺炎、支氣管炎、

3、扁桃腺炎、腮腺炎等屬于中醫(yī)溫?zé)岵》懂牭牟《拘愿腥炯膊〉扔星袑嵂熜?其配方由連翹，金銀花，苦桔梗，薄荷，竹葉，生甘草，荊芥穗，淡豆豉，牛蒡子，蘆根等10味藥物組成;其中，金銀花、連翹既有辛涼透邪、清熱之功，又具芳香辟穢解毒之效;薄荷、牛蒡子為辛涼之性疏風(fēng)清熱而利咽喉。荊芥穗、淡豆豉為辛溫之性助君藥開皮毛而逐邪，芳香辟穢。竹葉可清上焦熱;蘆根可清熱生津;桔?？尚沃箍?。甘草既可調(diào)和諸藥，護胃安中，又可合桔梗清利咽喉。研究表明銀翹散中各組成分

4、均能夠可能發(fā)揮抑制RSV感染的作用。本研究建立體內(nèi)RSV感染小鼠呼吸系統(tǒng)模型和體外RSV感染小鼠上皮細胞TC-1模型，采用低、中、高劑量銀翹散（分別為150mg/kg、300 mg/kg和600mg/kg）和利巴韋林(150mg/kg)進行治療，通過對肺指數(shù)進行測定，HE染色觀察肺組織和鼻黏膜組織炎性浸潤等病理形態(tài)學(xué)改變，檢測炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達，從動物和細胞水平來觀察銀翹散對RSV所致的呼吸系統(tǒng)感染是否具有改

5、善的作用。
　　RSV感染常常導(dǎo)致免疫損傷和炎癥的出現(xiàn)。在活化炎癥因子的過程中，NALP3炎性體有不可或缺的作用。NALP3炎性體是核苷酸結(jié)構(gòu)域樣受體(NALPs)家族成員，是體內(nèi)免疫系統(tǒng)對病原體的感受器，可識別病原體并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。NALP3炎性體由NOD樣受體家族成員3(NALP3)、調(diào)亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)、以及半胱天冬酶caspase-1組成。當(dāng)配體與NALP3結(jié)合后促進炎癥小體的形成，并對caspase-1

6、進行自身激活，導(dǎo)致IL-1β和IL-18等各種炎性因子的成熟及分泌，引起各種免疫炎癥反應(yīng)。因此本研究建立RSV感染呼吸系統(tǒng)的體內(nèi)外模型并給予銀翹散干預(yù)后，采用qPCR和western blot檢測NALP3炎性體相關(guān)蛋白NALP3、ASC和caspase-1的表達，探討銀翹散治療RSV感染作用與NALP3炎性體激活的關(guān)系，以期深入揭示銀翹散抗RSV感染效應(yīng)的免疫應(yīng)答信號機制，為RSV感染的臨床應(yīng)用進一步提供理論依據(jù)。
　　目的：<

7、br>　　探討銀翹散對呼吸道合胞病毒感染小鼠系統(tǒng)模型的治療效果以及作用機制。
　　方法：
　　第一部分:建立呼吸道合胞病毒感染小鼠呼吸系統(tǒng)模型;采用低、中、高劑量銀翹散(分別為150mg/kg、300mg/kg和600mg/kg)與利巴韋林陽性對照藥(150mg/kg)進行治療;通過稱量小鼠體重和肺重量計算肺指數(shù)。HE染色檢測小鼠鼻粘膜和肺組織炎性細胞浸潤等病理形態(tài)學(xué)的改變。酶聯(lián)免疫吸附法測定檢測小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL

8、-1β、TNF-α以及IL-6的表達水平。qPCR和western blot檢測小鼠肺組織中NALP3炎性體的相關(guān)因子NALP3、ASC和caspase-1的表達。
　　第二部分:建立呼吸道合胞病毒感染小鼠肺上皮細胞TC-1的體外模型，采用銀翹散與利巴韋林含藥血清進行干預(yù)，或者通過轉(zhuǎn)染NALP3小干擾RNA抑制NALP3表達;酶聯(lián)免疫吸附法測定檢測TC-1細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的表達;qPCR和w

9、estern blot檢測各組細胞NALP3、ASC和caspase-1的表達。
　　結(jié)果：
　　第一部分:體內(nèi)實驗表明采用銀翹散治療呼吸道合胞病毒感染的小鼠呼吸系統(tǒng)模型可以降低小鼠肺指數(shù)，減輕鼻黏膜上皮細胞和肺組織的損傷。并抑制NALP3炎性體相關(guān)蛋白NALP3、ASC和caspase-1的表達水平，降低炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達水平。且銀翹散對RSV感染小鼠呼吸系統(tǒng)的改善作用與利巴韋林陽性對照藥的改善

10、作用相當(dāng)。
　　第二部分:體外細胞實驗進一步證實銀翹散對RSV感染的改善作用，及其作用機制與NALP3炎性體激活相關(guān)。此外，給予NALP3小干擾RNA后發(fā)現(xiàn)其可逆轉(zhuǎn)RSV感染TC-1細胞所致的IL-1β、TNF-α和IL-6及NALP3炎性體相關(guān)蛋白NALP3、ASC和caspase-1的表達水平升高。
　　結(jié)論：
　　銀翹散在體內(nèi)外實驗中均能夠改善呼吸道合胞病毒感染所致的呼吸道系統(tǒng)炎癥，其作用機制與抑制NALP3炎性