重組人干擾素α1b對呼吸道合胞病毒感染小鼠的抗病毒及免疫調節(jié)作用.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV)感染可引起嬰幼兒發(fā)生嚴重的毛細支氣管炎、肺炎甚至死亡,也是誘發(fā)兒童哮喘的重要危險因素[1,2]。然而,目前治療RSV感染尚無特異性抗病毒藥物[3],探尋一種既安全又有效可用于預防和(或)治療RSV感染的抗病毒藥物仍舊迫切需要。
　　重組人干擾素α1b(recombinanthumaninterferon-α1b,rhIFN-α1b)是一類由我國自主研制成功

2、獲得我國生產批文的基因工程類正規(guī)藥品[4],目前主要應用于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎及某些惡性腫瘤的治療[5,6],具有明顯的抗病毒、抗腫瘤及免疫調節(jié)功能。然而,關于rhIFN-α1b治療兒童RSV感染僅限國內報道,缺乏正規(guī)統(tǒng)一的規(guī)范化治療指南,且國內多位專家共識[7]認為“α-干擾素作為抗病毒治療常用藥物,已有臨床使用經驗,但尚無兒童霧化吸入推薦劑量,其有效性也需進一步證實”。
　　本科RSV系列實驗前期研究了rhIFN-α1b

3、霧化吸入對RSV感染小鼠的作用[8]以及小兒病毒性肺炎患兒肌內注射rhIFN-α1b的安全性和耐受性[4]。前者研究發(fā)現霧化吸入rhIFN-α1b12μg對RSV感染小鼠治療有效[8],后者研究發(fā)現在0.3~2.0μg/kg范圍內肌內注射rhIFN-α1b對于小兒病毒性肺炎恢復期患兒耐受性良好,無明顯毒副作用[4]。因此,本實驗研究rhIFN-α1b多劑量、大劑量霧化吸入對RSV感染小鼠的作用,試圖進一步探討rhIFN-α1b對RSV感

4、染小鼠的抗病毒及免疫調節(jié)作用。
　　目的:
　　本實驗旨在采用rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入和rhIFN-α1b腹腔注射兩種方式對RSV感染小鼠進行干預,通過光鏡和透射電鏡觀察肺組織病變,熒光定量RT-PCR檢測肺組織RSV病毒載量,流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群和ELISA方法檢測血清細胞因子水平的方法,探討rhIFN-α1b對RSV感染小鼠的抗病毒及免疫調節(jié)作用,為rhIFN-α1b治療兒童呼吸道RSV感染的臨床

5、用藥提供一定的實驗依據。
　　方法:
　　1)培養(yǎng)Hep-2細胞,增殖RSV,收集病毒液。
　　2)提取病毒液RNA,熒光定量RT-PCR進行鑒定。
　　3)鑒定其為RSV后,測定病毒滴度TCID50。
　　4)將BALB/c小鼠隨機分為10組,每組10只,分別為空白對照組(1組)、陰性對照組(1組)、RSV感染模型組(1組)、rhIFN-α1b(3.125μg、12.5μg、25μg、50μg)霧化吸入組

6、(4組)、利巴韋林霧化吸入組(1組)、rhIFN-α1b腹腔注射組(1組)、利巴韋林腹腔注射組(1組)。
　　5)RSV病毒液滴鼻,成功建立RSV感染小鼠模型后,按照分組連續(xù)給予各組小鼠(霧化吸入或腹腔注射)干預治療5天(空白對照組除外)。
　　6)于次日采集小鼠全血,流式細胞術檢測CD3+CD4+與CD3+CD8+水平,計算兩者比值。
　　7)分離小鼠血清,ELISA檢測IFN-γ、IL-4、IL-17水平。

7、　　8)剖取小鼠肺組織,制作HE染色切片,光鏡下觀察小鼠肺組織病理學改變,計算組織病理學評分。
　　9)制作電鏡超薄切片,透射電鏡下觀察小鼠肺組織超微結構改變。
　　10)熒光定量RT-PCR檢測小鼠肺組織RSV病毒載量。
　　11)統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1)Hep-2細胞培養(yǎng)及RSV增殖過程順利。
　　2)熒光定量RT-PCR建立標準曲線:斜率-2.62,Y軸截距39.5,相關系數0.990

8、,基線范圍6~15,閾值0.16,即得到標準曲線方程式Y=-2.62X+39.5。病毒液核酸檢測結果陽性,鑒定其為RSV,可用于后續(xù)實驗。
　　3)根據Reed-Muench公式,計算得出RSV病毒液TCID50=10-4.6。
　　4)RSV感染小鼠表現為不同程度的精神萎靡,運動遲緩,飲食減少,呼吸急促,毛發(fā)豎立無光澤,部分表現有咳嗽及打噴嚏癥狀,提示RSV感染小鼠模型建立成功。
　　5)光鏡下可見RSV感染模型組小

9、鼠肺組織支氣管與細支氣管周大量淋巴細胞浸潤,管腔內大量分泌物滲出,肺泡隔顯著增寬,肺泡腔狹窄或消失,肺泡腔內可見紅細胞及淡紅色透明水腫液。RSV感染模型組小鼠肺組織病理學評分(24.600分±1.342分)與陰性對照組(1.600分±2.191分)和空白對照組(0.800分±1.789分)比較顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組可見,隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠肺組織炎性損傷程度下降,肺組織病

10、理學評分呈遞減趨勢,4個劑量組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與RSV感染模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),rhIFN-α1b3.125μg霧化吸入組除外。利巴韋林霧化吸入組小鼠肺組織炎性損傷程度較rhIFN-α1b25μg霧化吸入組嚴重,利巴韋林腹腔注射組比rhIFN-α1b腹腔注射組肺組織炎性損傷程度略重。
　　6)透射電鏡下可見RSV感染模型組小鼠肺泡隔顯著增厚,充血、出血、水腫明顯,部分有肺實變表現,肺泡

11、腔縮小或消失,腔內可見紅細胞與壞死、脫落的細胞碎片等;Ⅰ型肺泡上皮細胞為早期凋亡表現,胞核異形改變,核染色質邊集凝聚,胞質內吞飲小泡數量明顯降低,次級溶酶體數量增多,線粒體數量減少,細胞表面微絨毛變性壞死,雜亂分布,膠原成分形成,細胞連接疏松,部分已經完全脫落;Ⅱ型肺泡上皮細胞少有早期凋亡表現,胞核變化不大,胞質內線粒體數量增多,嗜鋨性板層小體數量增多,分泌、胞吐現象活躍。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組可見,小鼠肺組織炎性損傷程度

12、明顯減輕。利巴韋林霧化吸入組可見程度不一的高電子密度致密物沉積現象,連接成線狀或帶狀均勻分布于肺泡隔基底膜區(qū)域,而rhIFN-α1b霧化吸入組與2個腹腔注射組均未觀察到此類現象。
　　7)熒光定量RT-PCR檢測結果顯示陰性對照組與空白對照組小鼠肺組織未檢出RSV,RSV感染模型組小鼠肺組織RSV病毒載量最高(153.706±18.982)copies/mg,與其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),rhIFN-α1b3

13、.125μg霧化吸入組與利巴韋林腹腔注射組除外。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組結果顯示,隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠肺組織RSV病毒載量呈遞減趨勢,rhIFN-α1b25μg霧化吸入組與rhIFN-α1b50μg霧化吸入組抗病毒作用顯著,與其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rhIFN-α1b腹腔注射組與利巴韋林腹腔注射組小鼠肺組織RSV病毒載量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　8)流式細胞術檢測結果

14、顯示RSV感染模型組小鼠外周血CD3+CD4+水平(78.820％±0.973%)最高,CD3+CD8+水平(18.020%±1.628%)最低,兩者比值(4.404±0.415)顯著升高,與陰性對照組和空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組結果顯示,隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠外周血CD3+CD4+水平逐漸下降,CD3+CD8+水平逐漸回升,兩者比值降低,rhIFN-α1b50μg霧化吸

15、入組與其余各藥物干預組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),rhIFN-α1b25μg霧化吸入組除外。rhIFN-α1b腹腔注射組與利巴韋林腹腔注射組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　9)ELISA檢測結果顯示RSV感染模型組小鼠血清IFN-γ水平最低(39.386pg/mL±11.942pg/mL),IL-4(131.241pg/mL±15.388pg/mL)與IL-17(132.080pg/mL±17.659pg/

16、mL)水平最高,與陰性對照組和空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入組結果顯示,隨著霧化吸入劑量的倍增,小鼠血清IFNγ水平逐漸回升,IL-4與IL-17水平逐漸下降,rhIFN-α1b50μg霧化吸入組與其余組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。rhIFN-α1b腹腔注射組與利巴韋林腹腔注射組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論:
　　1)rhIFN-α1b霧化

17、吸入對RSV感染小鼠肺組織病毒載量具有良好的抑制作用。
　　2)rhIFN-α1b霧化吸入對RSV感染小鼠外周血T淋巴細胞亞群失衡具有良好的調節(jié)作用。
　　3)rhIFN-α1b霧化吸入對RSV感染小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-17水平具有良好的調節(jié)作用。
　　4)rhIFN-α1b不同劑量霧化吸入對RSV感染小鼠的抗病毒及免疫調節(jié)作用存在一定的劑量-效應關系。
　　5)rhIFN-α1b50μg霧化吸入對