體外誘導外周血單個核細胞向肝樣細胞分化的研究.pdf

1、干細胞是一類具有無限或永生的自我更新能力的細胞，能產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細胞。在個體發(fā)育的不同階段及成體不同組織中均存在著干細胞，來源于各種組織的成體干細胞在適當?shù)奈h(huán)境中能分化為其他類型的細胞，即成體干細胞具有可塑性。 人外周血單個核細胞包括單核細胞、干細胞和淋巴細胞，通過密度梯度離心法，收集外周血單個核細胞，利用單核細胞可粘著于塑料培養(yǎng)器皿表面的特性，可去除未貼壁細胞，進一步純化單核細胞。巨噬細胞集落刺激因子(m

2、acrophage colony stimulating factor，M-CSF)可促進單核細胞增殖分化，白細胞介素—3(interleukin-3，IL-3)可促進單核細胞分化及多能干細胞自我更新。這兩種因子的聯(lián)合應用對單核細胞的可塑性具有協(xié)同作用，可使外周血單核細胞產(chǎn)生部分未分化，具有重新分化能力并對刺激它們終末分化的因子反應下調(diào)，使這些單核細胞來源的細胞被誘導分化為肝樣細胞成為可能。 細胞的分化和再生受細胞因子或生長因子

3、的控制，在大多數(shù)的研究中，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growthfactor,TGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)應用最多。曾有報道，在研究多潛能人祖細胞(hMAPCs)轉(zhuǎn)分化實驗時，分析比較了多種細胞因子的作用，如FGF、白

4、血病抑制因子(1eukaemia inhibitory factor，LIF)、HGF、制瘤素M(oncostatin M,OSM)、EGF等，得出在HGF和FGF-4存在的情況下分化為肝樣細胞的培養(yǎng)條件較好。 目前對急性或晚期肝病引起的肝功能衰竭，最佳治療方法是肝移植，原位肝移植由于供體器官緊缺，其應用受到限制。采用細胞移植技術來修復、治療終末期肝病患者，幫助患者度過危險期等待肝移植或者直接修復衰竭肝臟，是一個理想的方法，因此

5、尋找合適的肝細胞來源備受關注。外周血有收集方便、供體不需要麻醉、無骨髓穿刺痛苦、易于患者接受等優(yōu)點，因此用外周血干細胞移植的方法來獲得轉(zhuǎn)分化后的肝樣細胞，其臨床應用前景非常突出。 目的：探索人外周血單個核細胞在HGF及FGF-4誘導下分化為肝樣細胞的可行性。 方法： 1．采集正常健康志愿獻血者的外周血，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。 2．用RPMI1640培養(yǎng)液對外周血單個核細胞培養(yǎng)2小時后，去除未

6、貼壁細胞。 3．在含10％胎牛血清、140uM β-巰基乙醇、5ng/ml M-CSF、0.4ng/ml IL-3的RPMI1640培養(yǎng)液中對貼壁細胞培養(yǎng)6天。 4．6天后，用含10％胎牛血清、20ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)誘導培養(yǎng)20天，即對外周血單個核細胞總共培養(yǎng)約26天。 5．觀察細胞培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化，加入HGF、FGF-4誘導前及誘導后的第6、10、14

7、、20天采用免疫熒光法檢測肝細胞標志物甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)的表達情況。 結(jié)果： 1．剛分離的單個核細胞形態(tài)上呈較為均一的圓形，臺盼蘭染色法測定活細胞率>95％，培養(yǎng)2小時后去除未貼壁細胞，貼壁細胞形態(tài)呈毛毛糙糙的圓形。 2．在M-CSF、IL-3存在的條件下，對貼壁細胞培養(yǎng)6天后，可見細胞呈集落樣生長，細胞趨向融合。未用M-CSF、IL-3培養(yǎng)或單用M-

8、CSF培養(yǎng)的對照組細胞呈單個細胞生長，隨培養(yǎng)時間延長，貼壁伸展，培養(yǎng)2周后大部分呈纖維樣或梭形，少部分呈圓形。 3．加入HGF、FGF-4培養(yǎng)后4天左右，可見部分細胞體積變大，向類圓形細胞轉(zhuǎn)變，隨培養(yǎng)時間延長，類圓形細胞比例增加。培養(yǎng)20天后，細胞數(shù)量較未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)前減少。未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)的對照組細胞，隨培養(yǎng)時聞的延長，部分細胞貼壁伸展，培養(yǎng)20天后大部分呈梭形或纖維樣，少部分呈圓形。 4．實

9、驗組加入HGF、FGF-4培養(yǎng)后第6、10、14、20天免疫熒光法檢測AFP均為陽性表達。實驗組未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)前及對照組于實驗組相應檢測日期免疫熒光法檢測AFP均為陰性表達。 5．實驗組加入HGF、FGF-4培養(yǎng)后第10、14、20天免疫熒光法檢測ALB均為陽性表達。實驗組未加入HGF、FGF-4培養(yǎng)前及對照組于實驗組相應檢測日期免疫熒光法檢測ALB均為陰性表達。 結(jié)論：外周血單個核細胞在一定誘導條件下具有