髓核細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：
　　腰痛是造成社會(huì)勞動(dòng)力喪失的首要原因，由于這種疾病造成的殘疾則導(dǎo)致更大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。雖然腰痛的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，但大量證據(jù)表明，椎間盤(pán)退行性疾病為最常見(jiàn)的原因，退變本質(zhì)特征是椎間盤(pán)內(nèi)有核細(xì)胞數(shù)量減少和功能降低。為了恢復(fù)椎間盤(pán)原有的解剖及生理功能，很多研究者轉(zhuǎn)向生物治療方向?qū)ふ铱尚行苑桨福渥羁尚械姆椒ň褪亲甸g盤(pán)的組織工程治療，其中干細(xì)胞治療被認(rèn)為是最有前景的治療方法。很多研究已經(jīng)表明，干

2、細(xì)胞與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后可向髓核細(xì)胞方向分化，但其中的具體機(jī)制仍不清楚。
　　近年來(lái)，關(guān)于外泌體的研究逐漸成為熱點(diǎn)，外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體形成并分泌到細(xì)胞基質(zhì)中的一類(lèi)囊泡，通過(guò)自分泌、旁分泌或遠(yuǎn)距分泌方式與其他細(xì)胞進(jìn)行相互作用。其功能與細(xì)胞來(lái)源密切相關(guān)。在本研究中我們提出假設(shè)，髓核細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有某些髓核細(xì)胞的功能，參與了髓核細(xì)胞與干細(xì)胞共培養(yǎng)中的信息傳遞，是髓核細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　1.

3、髓核細(xì)胞外泌體提純方法：1）髓核細(xì)胞取自椎間盤(pán)手術(shù)病人術(shù)后椎間盤(pán)組織，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增;2）制備去血清外泌體的完全培養(yǎng)基，對(duì)髓核細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液;3）采用差異超速離心法對(duì)髓核細(xì)胞外泌體進(jìn)行分離提純。
　　2.髓核細(xì)胞外泌體的鑒定：1）用透射電子顯微鏡對(duì)提取的髓核細(xì)胞外泌體進(jìn)行大小及形態(tài)的觀察;2）通過(guò)western-blot檢測(cè)其表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白的情況，并對(duì)其所含細(xì)胞碎片及細(xì)胞器等雜質(zhì)蛋白進(jìn)行鑒定。
　　3

4、.髓核細(xì)胞外泌體被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞攝取的觀察：利用親脂性熒光染料PKH67對(duì)外泌體脂質(zhì)膜進(jìn)行標(biāo)記，然后與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共孵育后，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)髓核細(xì)胞外泌體的攝取情況。
　　4.髓核細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞分化：1）用髓核細(xì)胞外泌體對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)3，7，10，14天后，觀察BMSCs的形態(tài)變化及阿爾新藍(lán)染色觀察其表達(dá)糖胺聚糖的變化，另外利用qRT-PCR及WB方法對(duì)髓核特異

5、性表達(dá)基因Aggrecan、SOX-9、CollagenⅡ、HIF-1α、CA12及KRT19進(jìn)行檢測(cè)，觀察其向髓核細(xì)胞分化的情況。2）對(duì)比髓核細(xì)胞外泌體對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與間接共培養(yǎng)系統(tǒng)的差異，實(shí)驗(yàn)組為髓核細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的外泌體組，利用transwell嵌套系統(tǒng)進(jìn)行髓核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的共培養(yǎng)組和空白骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對(duì)照組，對(duì)上述基因進(jìn)行檢測(cè)，比較這兩種不同方式在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的差異

6、。
　　結(jié)果：
　　1.人髓核細(xì)胞可以分泌胞外囊泡，且這些囊泡具有經(jīng)典外泌體的大小形態(tài)及標(biāo)志蛋白。這些囊泡大致分布在30-100nm之間，且高表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD63及Tsg101，證明其起源于細(xì)胞內(nèi)多囊泡體，屬于外泌體。同時(shí)所提取的囊泡不表達(dá)Calnexin，排除其為細(xì)胞碎裂后釋放的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分，說(shuō)明經(jīng)差異超速離心法獲得的髓核細(xì)胞外泌體純度較高，無(wú)細(xì)胞器雜質(zhì)污染。
　　2.髓核細(xì)胞外泌體在體外可以被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所

7、攝取，且其攝取方式為胞吞作用。
　　3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)髓核細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)3、7、10、14天后，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，阿利新藍(lán)染色觀察其蛋白聚糖的分泌情況，qRT-PCR檢測(cè)分化后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)髓核細(xì)胞特異標(biāo)志物ACAN、SOX-9、Col2a1、CA12、HIF-1α和KRT19均呈明顯上升趨勢(shì)，7天以后與空白對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)。Wsetern-blot檢測(cè)Aggrecan、Sox-9、c

8、ollagenⅡ、CA12和KRT19表達(dá)變化與基因水平基本一致。
　　4.髓核細(xì)胞外泌體對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)能力明顯強(qiáng)于transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)。兩組實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較ACAN、SOX-9、Col2a1、CA12、HIF-1α和KRT19基因表達(dá)均升高，兩組實(shí)驗(yàn)組比較除KRT19表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，外泌體組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)其他髓核細(xì)胞標(biāo)志物的水平顯著高于共培養(yǎng)組及空白對(duì)照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：<

9、br>　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人髓核細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，利用差異超速離心法首次分離提純了髓核細(xì)胞外泌體，這些外泌體具有經(jīng)典外泌體的大小形態(tài)同時(shí)表達(dá)外泌體特有標(biāo)志蛋白。髓核細(xì)胞外泌體可以被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所攝取，經(jīng)基因及蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的效應(yīng)為促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞方向分化，通過(guò)與間接共培養(yǎng)方式比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)髓核細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)髓核細(xì)胞標(biāo)志物水平高于間接共培養(yǎng)系統(tǒng)。由此推斷，髓核細(xì)胞可以分泌外泌體，其攜帶髓核細(xì)