GDF6誘導(dǎo)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞分化的研究.pdf

1、背景：椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease,DDD)引起的下腰痛是當(dāng)今社會(huì)中的一種常見疾病，但目前的治療手段都屬對(duì)癥治療,無法阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。有文獻(xiàn)報(bào)道在髓核組織中存在髓核間充質(zhì)干細(xì)胞，相較于其他成體間充質(zhì)干細(xì)胞來說對(duì)椎間盤的微環(huán)境更具優(yōu)勢(shì)。最近國外有研究證明一種新的生長因子—生長分化因子6（growth differentiation factor6,GDF6）能高效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為髓核樣細(xì)

2、胞，但在誘導(dǎo)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞分化的研究未見報(bào)道。因此，如果能通過誘導(dǎo)劑GDF6，對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行人工干預(yù)，探討 GDF6對(duì)誘導(dǎo)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響，為尋找椎間盤退變性疾病新的治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：建立大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，觀察大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特性及生物學(xué)特性。研究生長因子GDF6對(duì)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響。
　　方法：1.無菌條件下取大鼠尾椎的髓核

3、組織，用Ⅱ型膠原酶消化分離椎間盤髓核組織后培養(yǎng)，胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。2.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)來檢測大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面免疫表型：CD105、CD90是否陽性表達(dá)，CD34、CD45是否陰性表達(dá)；運(yùn)用RT-PCR檢測間充質(zhì)干細(xì)胞基因SOX2、Nanog的表達(dá)。3.按照培養(yǎng)條件的不同分為兩組：A：標(biāo)準(zhǔn)軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（不含 TGF-β3）；B：標(biāo)準(zhǔn)軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（不含TGF-β3）+GDF6（100ng/ml）。培養(yǎng)14天后通過熒光定

4、量PCR檢測各組細(xì)胞的KRT8、KRT18、KRT19基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：大鼠髓核組織來源細(xì)胞在經(jīng)原代培養(yǎng)4-6天后即可見部分細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)部分為短梭形狀，多數(shù)部分為多角形細(xì)胞，12天左右后可見部分細(xì)胞形成集落，3-4周后細(xì)胞融合可達(dá)90％。傳代后細(xì)胞增殖明顯加快，約一周左右即可再次傳代，梭形細(xì)胞開始增多。到第三代時(shí)可見細(xì)胞大多為長梭形，待細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，可見細(xì)胞呈漩渦狀生長。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測所培養(yǎng)細(xì)胞的表面免疫分

5、子標(biāo)志：CD105、CD90陽性表達(dá)，CD34、CD45陰性表達(dá)；運(yùn)用 RT-PCR檢測所培養(yǎng)細(xì)胞可表達(dá)干細(xì)胞基因SOX-2、Nanog。經(jīng)GDF6誘導(dǎo)分化后，通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組較對(duì)照組細(xì)胞的 KRT8、KRT18、KRT19基因的表達(dá)明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.本實(shí)驗(yàn)成功的在體外分離培養(yǎng)出大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞。2.GDF6具有誘導(dǎo)大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化的作用，為髓核間充質(zhì)干