亮氨酸拉鏈對人副流感病毒3型HN蛋白功能的影響.pdf

1、副粘病毒是一類對人和動物致病的重要病毒，在世界范圍內流行，分為兩個亞科：副粘病毒亞科和肺病毒亞科。副粘病毒亞科包括副粘病毒屬、麻疹病毒屬和腮腺炎病毒屬；副粘病毒屬主要包括人副流感病毒（hPIV）、新城疫病毒（NDV）和仙臺病毒（SV），麻疹病毒屬主要包括麻疹病毒（MV），腮腺炎病毒屬主要有流行性腮腺炎病毒（MuV）。肺病毒亞科只包括肺病毒屬，主要有人和牛呼吸道合胞病毒（RSV）。 副粘病毒能夠引起人類呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病，如上

2、呼吸道感染、支氣管炎、毛細支氣管炎、肺炎、結膜炎、睪丸炎、卵巢炎等等，嚴重時甚至引起死亡。其中，MV、MuV、RSV等能引起兒童常見病，如麻疹、流行性腮腺炎以及呼吸道感染等。人副流感病毒3型（hPIV3）是嬰幼兒毛細支氣管炎和肺炎的第二大病因，還可引起嬰幼兒的哮吼和喉炎。目前尚無有效的抗hPIV3治療措施。除感染人類外，副粘病毒還能感染動物如禽類、馬類、豬類等。NDV是重要的禽類傳染病病原體，往往引起災難性的、廣泛流行的疾病。此外，ND

3、V尚有一定的臨床意義，如誘導干擾素（IFN）、免疫調節(jié)、腫瘤治療等。 本研究在原有工作的基礎上，利用定點突變技術構建hPIV3 HN蛋白促細胞融合區(qū)域兩端亮氨酸拉鏈中的保守氨基酸突變體，然后檢測突變體與同源F蛋白共表達后的促細胞融合活性以及受體結合活性、細胞表面表達效率，從而確定亮氨酸拉鏈對hPIV3 HN蛋白功能的影響。 一、TM區(qū)亮氨酸拉鏈突變體對促細胞融合活性的影響 hPIV3 HN蛋白TM區(qū)亮氨酸拉鏈由

4、氨基酸L36～150組成，其中L36、L43和I50等氨基酸在副粘病毒中高度保守，采用同源重組PCR方法進行定點突變構建突變體。每個突變體需要設計兩對含同源序列的引物，進行兩次PCR。獲得的兩個PCR產物含有短同源末端序列，將其同時轉染大腸桿菌TG1后，二者會自動重組形成完整的含突變位點的質粒。為避免引入額外突變，引物中未引入酶切位點。轉染后提取質粒，電泳結果正確，經測序證實引入突變，成功將各保守氨基酸突變?yōu)楸彼幔ˋ）。由此得到3個單

5、獨突變體，分別命名為：L36A、L43A和I50A。在單獨突變的基礎上，構建1個聯(lián)合突變體，命名為L36A-L43A。將突變體分別轉染痘苗病毒vTF7-3預感染的BHK21細胞，采用定性（Giemsa染色）和定量（指示基因法）兩種方法檢測細胞融合情況。細胞融合功能經校正后，消除了蛋白表達效率的影響。結果顯示，與野生型（vvt）hPIV3 HN基因相比，各單獨突變體促細胞融合活性有不同程度的降低。以wtHN基因促細胞融合活性為100％，突

6、變體L36A融合活性為wtHN基因的66．66％，突變體L43A融合活性為、vt HN基因的60．60％，突變體150A融合活性為、wt HN基因的57．60％。聯(lián)合突變體L36A-L43A轉染后未見細胞融合形成。 hPIV3 HN蛋白頸部近膜區(qū)的亮氨酸拉鏈由氨基酸L114～I128組成，其中L114、L121和I128在副粘病毒中高度保守。采用同源重組PCR方法進行定點突變。突變后提取質粒后電泳結果正確，經測序證實成功引入突

7、變。由此得到3個單獨突變體，分別命名為：L114A、L121A和I128A。在單獨突變的基礎上，構建1個聯(lián)合突變體，命名為L121A-I128A。將突變體分別轉染痘苗病毒vTF7-3預感染的BHK21細胞，采用定性（Giemsa染色）和定量（指示基因法）兩種方法檢測細胞融合情況。受體結合活性經校正后，消除了蛋白表達效率的影響。以wt hPIV3 HN基因促細胞融合活性為100％，L114A促細胞融合活性為wtHN基因的53．00％，L1

8、21A促細胞融合活性為wtHN基因的59．10％，I128A促細胞融合活性為wtHN基因的90．90％。聯(lián)合突變體L121A-I128A轉染后未觀察到細胞融合。 頸部亮氨酸拉鏈附近及內部的氨基酸P111、I112和I125在副粘病毒中亦是保守位點。同樣以同源重組PCR方法獲得3個單獨突變體，分別命名為：P111A、I112A和I125A。將突變體分別轉染痘苗病毒vTF7-3預感染的BHK21細胞，采用定性（Giemsa染色）和定

9、量（指示基因法）兩種方法檢測細胞融合情況。促細胞融合活性經校正后，消除了蛋白表達效率的影響。以wt hPIV3 HN基因促細胞融合活性為100％，P111A為wt HN的43．90％，1112A為wt HN的39．40％，1125A為wt HN的34．80％。 各突變體分別進行3次平行實驗，所得實驗數(shù)據采用秩和檢驗進行分析；秩和檢驗統(tǒng)計值H=28．78，P<0．05，表明各突變體促細胞融合活性差別有統(tǒng)計學意義，其中突變體I125

10、A活性最低，突變體I128A活性最高。 FACS分析表明，各突變體都成功在細胞表面表達，但與wt HN基因相比，表達效率有所降低。 二、亮氨酸拉鏈突變體對受體結合活性的影響 將上述獲得的11個突變體L36A、L43A、I50A、L114A、L121A、I128A、P111A、I112A、I125A、L36A-L43A和L121A-I128A分別轉染痘苗病毒vTF7-3預感染的BHK21細胞，采用血吸附實驗檢測突

11、變體的受體結合活性。受體結合活性經校正后，消除了蛋白表達效率的影響。結果表明各突變體對受體結合活性影響較小。與wt hPIV3 HN基因相比，TM區(qū)亮氨酸拉鏈的3個突變體中，突變體L36A受體結合活性和wt HN基因一樣，為100％，而突變體L43A和150A受體結合活性稍低，分別為wt HN基因的98．99％和91．92％。頸部近膜區(qū)亮氨酸拉鏈的3個突變體L114A、L121A和I128A受體結合活性分別為wt hPIV3 HN的95

12、．96％、92．93％和100％。此外，突變體P111A為wt HN的97．98％， I112A為wt HN的95．96％，I125A為wt HN的85．86％。兩個聯(lián)合突變體受體結合活性也與wt HN基因接近，L36A-L43A受體結合活性為wt HN基因的95．96％，L1121A-I128A為wt HN基因的93．94％。 各突變體分別進行3次平行實驗，所得實驗數(shù)據采用秩和檢驗進行分析。秩和檢驗統(tǒng)計值H=17．99，P>0

13、．05，表明各突變體受體結合活性差別不存在統(tǒng)計學意義。 三、F蛋白對HN蛋白受體結合活性的影響 將上述11個突變體分別與F蛋白共轉染痘苗病毒vTF7-3預感染的BHK21細胞，采用血吸附實驗檢測突變體的受體結合活性。以wt HN基因受體結合活性為100％，突變體L36A受體結合活性最高，為wt HN基因的99．14％，突變體I125A受體結合活性最低，為wt HN的84．48％。采用秩和檢驗分析HN單獨表達（血吸附HN組

14、）與HN和F蛋白共表達（血吸附HN+F組）兩組受體結合活性的差別，結果H=108．00，P<0．05，表明兩組存在差別，血吸附HN組受體結合活性比血吸附HN+F組高。 從本實驗結果可得出結論： 本實驗成功構建了hPIV3 HN蛋白TM區(qū)和頸部近膜區(qū)兩個亮氨酸拉鏈中保守氨基酸的突變體，共獲得突變體11個，其中9個單獨突變體，分別為L36A、L43A、150A、L114A、L121A、I128A、P111A、I112A和I1

15、25A；在單獨突變的基礎上構建了兩個聯(lián)合突變體，L36A-L43A和L121A-I128A。 TM區(qū)和頸部近膜區(qū)兩個亮氨酸拉鏈對于hPIV3 HN蛋白促細胞融合活性具有重要的作用。其中的保守氨基酸突變后，促細胞融合活性均有不同程度的降低，最低的為突變體I125A，僅為wt HN的34．80％，而突變體I128A融合活性最高，為wt HN的90．90％。其它突變體融合活性在39．40％～66．66％之間。而兩個聯(lián)合突變體轉染后未

16、見細胞融合形成。這進一步證明hPIV3 HN蛋白促細胞融合區(qū)域不是位于頭部，而是位于TM區(qū)和頸部近膜區(qū)，并在氨基酸I125結尾，I125是對促細胞融合活性有著關鍵作用的氨基酸殘基；亮氨酸拉鏈結構的完整性是副粘病毒細胞融合所必需的，對HN蛋白促細胞融合作用有著重要的影響。 HN蛋白促細胞融合區(qū)域兩端亮氨酸拉鏈對受體結合活性并無影響。各突變體受體結合活性與wt HN非常接近；突變體I125A受體結合活性為wt HN的85．86％，