人副流感病毒3型融合蛋白連接區(qū)對膜融合功能的影響及機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對膜融合功能的影響及機制研究
　　目的:
　　確定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對膜融合活性的影響，探討DⅠ-DⅡ連接區(qū)影響膜融合功能的機制，以期為研究安全有效的疫苗和抗病毒藥物提供線索。
　　方法:
　　1.采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODEL軟件上以PIV5(PIV5)F蛋白融合前構象的晶體結構(PDB I

2、D:4GIP)為模板得到HPIV3 F蛋白的融合前構象的模型，以確定DⅠ-DⅡ連接區(qū)在融合前構象上的位置。
　　2.采用定點突變和體內同源重組相結合的方法構建出該區(qū)域(369aa-374aa)的九個單氨基酸突變體，測序確定構建成功后將它們在真核瞬時表達系統內進行蛋白表達。
　　3.采用三種不同類型的膜融合試驗，即吉姆薩染色法，指示基因法，染料轉移法，定性和定量檢測各突變體蛋白對膜融合功能的影響。
　　4.采用流式細胞術

3、來檢測各突變體F蛋白在細胞表面的表達效率。
　　5.采用免疫共沉淀試驗來檢測各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細胞表面的相互作用能力。
　　6.采用SPSS17.0軟件進行數據處理，應用Student's t-檢驗對突變體和野生型F蛋白的實驗數據進行分析比較，P＜0.05被認為差別具有統計學意義。
　　結果:
　　1.成功構建出HPIV3 F蛋白融合前構象的同源結構模型，通過氨基酸序列比對確定了HPIV3 F

4、蛋白融合后構象的DⅠ-DⅡ連接區(qū)（369-374aa）在它的融合前構象中仍然扮演DⅠ-DⅡ連接區(qū)的角色。HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)的9個單氨基酸突變體(K369A、K369E、S370A、D371A、I372A、V373A、V373T、P374A和P374T)均構建成功。
　　2.各突變體F蛋白在膜融合過程的所有階段均表現出降低的膜融合活性。與野生型蛋白相比，突變體F蛋白形成的合胞體不僅數目減少而且面積也較小，其中K369

5、E、S370A、V373A、V373T和P374T突變體幾乎喪失了形成合胞體的能力，僅為野生型的5％以下，內容物混合的能力也極度降低，分別為野生型的18.0％、17.3％、16.4％、18.9％和15.4％，同時它們的半融合活性也大幅度降低，半融合的速率和程度均低于野生型水平的15％;而剩下的4個突變體（K369A、D371A、I372A和P374A）雖具有合胞體形成能力，但均低于野生型水平，其中K369A和D371A突變體內容物混合的

6、能力均約為野生型的66.7％，半融合的速率和程度約為野生型水平的五分之四(82.2％、82.0％)和四分之三(74.5％、75.2％)，而I372A和P374A突變體內容物混合的能力分別為野生型的水平的57.6％和54.5％，半融合的速率分別降低到野生型水平的58.5％和51.8％，半融合的程度分別降低為野生型的62.6％和60.6％。
　　3.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的突變對F蛋白在細胞表面的表達水平無影響。各突變體F蛋白在細胞表面的表

7、達水平均處于野生型F蛋白的93.1％～105.9％之間，與野生型相比差別無統計學意義(P＞0.05)。
　　4.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的各突變體與HPIV3 HN蛋白在細胞表面的相互作用能力均降低，其中K369E、V373A、V373T和P374T這4個突變體幾乎喪失了與HN蛋白相互作用的能力，均低于野生型水平的10％; S370A突變體與HN蛋白相互作用的能力約為野生型的五分之一;K369A、D371A、I372A和P374A突變體與

8、HN蛋白相互作用的能力分別為野生型的41.4％、66.0％、26.9％和15.2％。
　　結論:
　　HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對膜融合功能有重要影響，且各氨基酸殘基對膜融合活性影響的程度不同。膜融合活性的降低可能是由于突變導致各突變體F蛋白與同源性HN蛋白在細胞表面的相互作用能力降低所致。
　　第二部分 人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結構對膜融合功能的影響及機制研究
　　目的:<

9、br>　　確定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結構對膜融合活性的影響，尋找亮氨酸拉鏈類似結構干擾膜融合功能的機制。
　　方法:
　　采用PCR定點突變和體內同源重組相結合的方法將該區(qū)域的亮氨酸和其它保守氨基酸（L257、V264、L271、L278、L285、Q292和I299）分別突變?yōu)楸彼幔瑫r將中間的三個高度保守的亮氨酸（L271、L278和L285）進行了聯合突變，應用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶

10、瞬時表達系統于BHK-21細胞內進行蛋白表達，之后采用合胞體形成試驗、內容物混合試驗、R18探針試驗，半融合動力學試驗檢測突變對膜融合功能的影響;采用流式細胞術檢測各突變體F蛋白在細胞表面的表達水平;采用免疫共沉淀試驗來檢測突變對HN蛋白和F蛋白在細胞表面的相互作用能力的影響。采用SPSS17.0軟件進行數據處理，應用Student，st-檢驗對突變體和野生型F蛋白的實驗數據進行分析比較，P＜0.05被認為差別具有統計學意義。
　

11、　結果:
　　1.應用PCR單點突變和聯合突變的方法成功構建出了HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結構的7個單點突變體(L257A、V264A、L271A、L278A、L285A、Q292A和I299A)、3個二聯突變體(L271A-L278A、L271A-L285A和L278A-L285A)和1個三聯突變體(L271A-L278A-L285A)。
　　2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達時，在膜融

12、合過程的所有階段均表現出降低甚至消失的膜融合活性。與野生型相比，突變體蛋白形成的合胞體不僅數量減少而且面積也較小，3個單點突變體（L257A、L271A和I299A）和3個二聯突變體的合胞體形成能力極度降低，低于野生型水平的6.0％，內容物混合的能力只有野生型水平的16.0％以下，且只觀察到極少量的半融合事件，半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5％;而V264A、L285A和Q292A這3個突變體的合胞體形成能力略微降低，分別為野

13、生型水平的64.7％、69.1％和68.5％，內容物混合的能力仍維持在野生型水平的85％左右，介導半融合能力輕微降低，半融合的速率分別為野生型的88.8％、87.6％和85.0％，半融合的程度分別為野生型的85.5％、87.2％和83.1％;此外，L278A突變體的合胞體形成能力約為野生型水平的38.1％，內容物混合的能力只有野生型的一半，半融合的速率和程度分別為野生型水平的52.8％和60.6％;剩下的三聯突變體喪失了合胞體形成能力，

14、內容物混合能力僅為野生型的2.2％，也沒有觀察到半融合事件的發(fā)生，半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5％。
　　3.HPIV3 F蛋白亮氨酸拉鏈類似結構的各丙氨酸取代株在細胞表面的蛋白表達水平均與野生型近似，差別無統計學意義(P＞0.05)。
　　4.所有的突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細胞表面的相互作用能力均降低，其中三聯突變體沒有檢測到與HN蛋白的相互作用;3個二聯突變體與HN蛋白的相互作用能力約為野生型的一

15、半;L257A、L271A和I299A突變體與HN蛋白的相互作用能力低于野生型水平的30％;V264A、L278A、L285A和Q292A突變體與HN蛋白的相互作用能力分別為野生型水平的63.3％、65.1％、64.3％和66.7％。
　　結論:
　　HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)的亮氨酸拉鏈類似結構對膜融合活性有重要影響;其中三聯突變體對膜融合活性的影響最大;該結構的完整性是完成膜融合過程必不可少的。
　　第三

16、部分 人副流感病毒3型F蛋白HRB連接區(qū)對膜融合功能的影響及機制研究
　　目的:
　　確定HPIV3 F蛋白HRB連接區(qū)對膜融合功能的影響，探討該區(qū)域影響膜融合功能的機制。
　　方法:
　　采用定點突變和體內同源重組相結合的方法將HRB連接區(qū)內的T429、E432、I443和N446位氨基酸進行單點突變，應用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬時表達系統于BHK-21細胞內進行蛋白表達，之后采用吉姆薩染色法、指示基因法

17、、染料轉移法檢測突變對膜融合活性的影響;采用SPSS17.0軟件進行數據處理，應用Student's t-檢驗對突變體和野生型F蛋白的實驗數據進行分析比較， P＜0.05被認為差別具有統計學意義。
　　結果:
　　1.成功構建了HRB連接區(qū)的6個突變體T429A、T429L、E432A、I443A、N446A和N446S。
　　2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達時，膜融合活性表現為兩種類型。T429A、T4

18、29L和N446A這3個突變體形成的合胞體不僅個數少，而且面積也比較小，內容物混合的能力也降低，只有野生型水平的36.6％、42.3％和15.2％，同時半融合活性只有野生型水平的34.8％、42.7％和12.4％;而E432A、I443A和N446S這3個突變體的膜融合活性均比野生型略增強，分別相當于野生型的109.4％、113.2％和118.6％，但半融合活性差別無統計學意義。
　　結論:
　　HPIV3 F蛋白HRB連接