人副流感病毒3型融合蛋白連接區(qū)對(duì)膜融合功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對(duì)膜融合功能的影響及機(jī)制研究
　　目的:
　　確定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對(duì)膜融合活性的影響，探討DⅠ-DⅡ連接區(qū)影響膜融合功能的機(jī)制，以期為研究安全有效的疫苗和抗病毒藥物提供線索。
　　方法:
　　1.采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODEL軟件上以PIV5(PIV5)F蛋白融合前構(gòu)象的晶體結(jié)構(gòu)(PDB I

2、D:4GIP)為模板得到HPIV3 F蛋白的融合前構(gòu)象的模型，以確定DⅠ-DⅡ連接區(qū)在融合前構(gòu)象上的位置。
　　2.采用定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法構(gòu)建出該區(qū)域(369aa-374aa)的九個(gè)單氨基酸突變體，測(cè)序確定構(gòu)建成功后將它們?cè)谡婧怂矔r(shí)表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)。
　　3.采用三種不同類型的膜融合試驗(yàn)，即吉姆薩染色法，指示基因法，染料轉(zhuǎn)移法，定性和定量檢測(cè)各突變體蛋白對(duì)膜融合功能的影響。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)

3、來檢測(cè)各突變體F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)效率。
　　5.采用免疫共沉淀試驗(yàn)來檢測(cè)各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力。
　　6.采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用Student's t-檢驗(yàn)對(duì)突變體和野生型F蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，P＜0.05被認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建出HPIV3 F蛋白融合前構(gòu)象的同源結(jié)構(gòu)模型，通過氨基酸序列比對(duì)確定了HPIV3 F

4、蛋白融合后構(gòu)象的DⅠ-DⅡ連接區(qū)（369-374aa）在它的融合前構(gòu)象中仍然扮演DⅠ-DⅡ連接區(qū)的角色。HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)的9個(gè)單氨基酸突變體(K369A、K369E、S370A、D371A、I372A、V373A、V373T、P374A和P374T)均構(gòu)建成功。
　　2.各突變體F蛋白在膜融合過程的所有階段均表現(xiàn)出降低的膜融合活性。與野生型蛋白相比，突變體F蛋白形成的合胞體不僅數(shù)目減少而且面積也較小，其中K369

5、E、S370A、V373A、V373T和P374T突變體幾乎喪失了形成合胞體的能力，僅為野生型的5％以下，內(nèi)容物混合的能力也極度降低，分別為野生型的18.0％、17.3％、16.4％、18.9％和15.4％，同時(shí)它們的半融合活性也大幅度降低，半融合的速率和程度均低于野生型水平的15％;而剩下的4個(gè)突變體（K369A、D371A、I372A和P374A）雖具有合胞體形成能力，但均低于野生型水平，其中K369A和D371A突變體內(nèi)容物混合的

6、能力均約為野生型的66.7％，半融合的速率和程度約為野生型水平的五分之四(82.2％、82.0％)和四分之三(74.5％、75.2％)，而I372A和P374A突變體內(nèi)容物混合的能力分別為野生型的水平的57.6％和54.5％，半融合的速率分別降低到野生型水平的58.5％和51.8％，半融合的程度分別降低為野生型的62.6％和60.6％。
　　3.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的突變對(duì)F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)水平無影響。各突變體F蛋白在細(xì)胞表面的表

7、達(dá)水平均處于野生型F蛋白的93.1％～105.9％之間，與野生型相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.DⅠ-DⅡ連接區(qū)的各突變體與HPIV3 HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力均降低，其中K369E、V373A、V373T和P374T這4個(gè)突變體幾乎喪失了與HN蛋白相互作用的能力，均低于野生型水平的10％; S370A突變體與HN蛋白相互作用的能力約為野生型的五分之一;K369A、D371A、I372A和P374A突變體與

8、HN蛋白相互作用的能力分別為野生型的41.4％、66.0％、26.9％和15.2％。
　　結(jié)論:
　　HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ連接區(qū)對(duì)膜融合功能有重要影響，且各氨基酸殘基對(duì)膜融合活性影響的程度不同。膜融合活性的降低可能是由于突變導(dǎo)致各突變體F蛋白與同源性HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力降低所致。
　　第二部分 人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結(jié)構(gòu)對(duì)膜融合功能的影響及機(jī)制研究
　　目的:<

9、br>　　確定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結(jié)構(gòu)對(duì)膜融合活性的影響，尋找亮氨酸拉鏈類似結(jié)構(gòu)干擾膜融合功能的機(jī)制。
　　方法:
　　采用PCR定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法將該區(qū)域的亮氨酸和其它保守氨基酸（L257、V264、L271、L278、L285、Q292和I299）分別突變?yōu)楸彼?，同時(shí)將中間的三個(gè)高度保守的亮氨酸（L271、L278和L285）進(jìn)行了聯(lián)合突變，應(yīng)用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶

10、瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)于BHK-21細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)，之后采用合胞體形成試驗(yàn)、內(nèi)容物混合試驗(yàn)、R18探針試驗(yàn)，半融合動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)突變對(duì)膜融合功能的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各突變體F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)水平;采用免疫共沉淀試驗(yàn)來檢測(cè)突變對(duì)HN蛋白和F蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力的影響。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用Student，st-檢驗(yàn)對(duì)突變體和野生型F蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，P＜0.05被認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

11、　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用PCR單點(diǎn)突變和聯(lián)合突變的方法成功構(gòu)建出了HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)亮氨酸拉鏈類似結(jié)構(gòu)的7個(gè)單點(diǎn)突變體(L257A、V264A、L271A、L278A、L285A、Q292A和I299A)、3個(gè)二聯(lián)突變體(L271A-L278A、L271A-L285A和L278A-L285A)和1個(gè)三聯(lián)突變體(L271A-L278A-L285A)。
　　2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達(dá)時(shí)，在膜融

12、合過程的所有階段均表現(xiàn)出降低甚至消失的膜融合活性。與野生型相比，突變體蛋白形成的合胞體不僅數(shù)量減少而且面積也較小，3個(gè)單點(diǎn)突變體（L257A、L271A和I299A）和3個(gè)二聯(lián)突變體的合胞體形成能力極度降低，低于野生型水平的6.0％，內(nèi)容物混合的能力只有野生型水平的16.0％以下，且只觀察到極少量的半融合事件，半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5％;而V264A、L285A和Q292A這3個(gè)突變體的合胞體形成能力略微降低，分別為野

13、生型水平的64.7％、69.1％和68.5％，內(nèi)容物混合的能力仍維持在野生型水平的85％左右，介導(dǎo)半融合能力輕微降低，半融合的速率分別為野生型的88.8％、87.6％和85.0％，半融合的程度分別為野生型的85.5％、87.2％和83.1％;此外，L278A突變體的合胞體形成能力約為野生型水平的38.1％，內(nèi)容物混合的能力只有野生型的一半，半融合的速率和程度分別為野生型水平的52.8％和60.6％;剩下的三聯(lián)突變體喪失了合胞體形成能力，

14、內(nèi)容物混合能力僅為野生型的2.2％，也沒有觀察到半融合事件的發(fā)生，半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5％。
　　3.HPIV3 F蛋白亮氨酸拉鏈類似結(jié)構(gòu)的各丙氨酸取代株在細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)水平均與野生型近似，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.所有的突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白在細(xì)胞表面的相互作用能力均降低，其中三聯(lián)突變體沒有檢測(cè)到與HN蛋白的相互作用;3個(gè)二聯(lián)突變體與HN蛋白的相互作用能力約為野生型的一

15、半;L257A、L271A和I299A突變體與HN蛋白的相互作用能力低于野生型水平的30％;V264A、L278A、L285A和Q292A突變體與HN蛋白的相互作用能力分別為野生型水平的63.3％、65.1％、64.3％和66.7％。
　　結(jié)論:
　　HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ偽連接區(qū)的亮氨酸拉鏈類似結(jié)構(gòu)對(duì)膜融合活性有重要影響;其中三聯(lián)突變體對(duì)膜融合活性的影響最大;該結(jié)構(gòu)的完整性是完成膜融合過程必不可少的。
　　第三

16、部分 人副流感病毒3型F蛋白HRB連接區(qū)對(duì)膜融合功能的影響及機(jī)制研究
　　目的:
　　確定HPIV3 F蛋白HRB連接區(qū)對(duì)膜融合功能的影響，探討該區(qū)域影響膜融合功能的機(jī)制。
　　方法:
　　采用定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組相結(jié)合的方法將HRB連接區(qū)內(nèi)的T429、E432、I443和N446位氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變，應(yīng)用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)于BHK-21細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá)，之后采用吉姆薩染色法、指示基因法

17、、染料轉(zhuǎn)移法檢測(cè)突變對(duì)膜融合活性的影響;采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用Student's t-檢驗(yàn)對(duì)突變體和野生型F蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較， P＜0.05被認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了HRB連接區(qū)的6個(gè)突變體T429A、T429L、E432A、I443A、N446A和N446S。
　　2.各突變體F蛋白與HPIV3 HN蛋白共表達(dá)時(shí)，膜融合活性表現(xiàn)為兩種類型。T429A、T4

18、29L和N446A這3個(gè)突變體形成的合胞體不僅個(gè)數(shù)少，而且面積也比較小，內(nèi)容物混合的能力也降低，只有野生型水平的36.6％、42.3％和15.2％，同時(shí)半融合活性只有野生型水平的34.8％、42.7％和12.4％;而E432A、I443A和N446S這3個(gè)突變體的膜融合活性均比野生型略增強(qiáng)，分別相當(dāng)于野生型的109.4％、113.2％和118.6％，但半融合活性差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　HPIV3 F蛋白HRB連接