人肺對流感病毒固有免疫應(yīng)答機制研究.pdf

1、本文研究了人肺對流感病毒固有免疫應(yīng)答機制。本研究分為四個部分：
　　 第一部分：人肺精確薄片體外移植培養(yǎng)模型的建立。
　　 目的：通過實驗探索人肺體外移植培養(yǎng)的條件，構(gòu)建人肺體外移植培養(yǎng)液的配置方案，優(yōu)化人肺標(biāo)本的處理和保存，穩(wěn)定切片后細(xì)胞，規(guī)范模型設(shè)備的使用和精確切片厚度的選擇，從而建立標(biāo)準(zhǔn)化流程，創(chuàng)建一個穩(wěn)定的、強大的、高產(chǎn)量、高重復(fù)性和實用性的多細(xì)胞共生長的人肺器官體外培養(yǎng)模型。
　　 方法：選取與俄克拉荷

2、馬大學(xué)合作的五家醫(yī)院中接受肺癌手術(shù)的志愿者的按University of Oklahoma Institutional Review Board批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)程序切除的正常肺葉組織，以及交通事故死亡遺體捐贈者的肺器官。參照改良的瓊脂糖充填肺組織的方法，以含1.5％低熔低膠瓊脂糖培養(yǎng)液，經(jīng)充膨、鉆取、切片及培養(yǎng)等步驟建立人肺精確薄片體外移植模型，并將人肺薄片進行長時間的體外培養(yǎng)，選取不同時間點對其生長狀態(tài)進行嚴(yán)密的顯微鏡下組織形態(tài)的監(jiān)測。以乳

3、酸脫氫酶釋放毒性實驗評價該模型建立體系對細(xì)胞的毒性。
　　 結(jié)果：建立的人肺精確薄片模型體系穩(wěn)定，無明顯的細(xì)胞毒性損傷，易重復(fù)、高產(chǎn)量。按此模型流程制備的人肺精確薄片經(jīng)長時間(>14天)的體外培養(yǎng)，整體結(jié)構(gòu)完整，三維立體結(jié)構(gòu)清楚，支氣管清晰可見，肺泡細(xì)胞隨培養(yǎng)時間活力無改變，共同維持了肺正常的結(jié)構(gòu)和功能。
　　 結(jié)論：按標(biāo)準(zhǔn)流程建立的人肺精確薄片體外移植模型體系穩(wěn)定，人肺薄片組織能經(jīng)受長時間體外培養(yǎng)，結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞穩(wěn)定，

4、是一個可重復(fù)使用替代人肺器官功能的體外培養(yǎng)模型。
　　 第二部分：流感病毒對移植培養(yǎng)人肺薄片的影響。
　　 目的：利用新建的人肺精確薄片體外移植培養(yǎng)模型，偵測暴露于流感病毒的人肺薄片里是否支持流感病毒的感染和病毒復(fù)制。
　　 方法：按照以低熔低膠瓊脂糖充填肺組織建立人肺精確薄片體外移植培養(yǎng)模型的標(biāo)準(zhǔn)流程獲取人肺薄片，分別暴露于6x106 PFU/ml流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(PR8)和A/Oklah

5、oma/309/06(H3N2)(OK/06)，經(jīng)不同時間的體外培養(yǎng)后收獲肺切片，以半定量RT-PCR和共聚焦顯微鏡偵測人肺薄片對流感病毒暴露的反應(yīng)。
　　 結(jié)果：暴露于流感病毒PR8和OK/06體外培養(yǎng)24h后的人肺薄片免疫結(jié)果顯示，在激光共聚焦顯微鏡下，暴露于流感病毒的人肺切片，可見在肺組織的多種細(xì)胞中存在紅色的熒光素信號，提示抗-PR8-NP和抗-OK/06-N P的存在，而在無病毒顆粒的稀釋液組僅看到染成蘭色的細(xì)胞核，說

6、明人肺薄片可被暴露的流感病毒感染。另外，半定量RT-PCR結(jié)果顯示，流感病毒PR8和OK/06 NS1mRNA的表達(dá)在流感病毒接觸后8h有顯著的高峰生成，說明體外培養(yǎng)的人肺薄片支持流感病毒的病毒復(fù)制。
　　 結(jié)論：暴露于流感病毒OK/06和PR8的人肺薄片，支持流感病毒的感染和病毒復(fù)制。
　　 第三部分：人肺多源細(xì)胞對流感病毒感染的反應(yīng)。
　　 目的：利用可被流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(PR8)感染的

7、人肺薄片體外移植培養(yǎng)的模型，偵測人肺內(nèi)流感病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)及人肺多細(xì)胞成分在參與人肺對流感病毒的固有免疫反應(yīng)中的作用。
　　 方法：按照新建的人肺薄片體外移植培養(yǎng)模型標(biāo)準(zhǔn)流程獲取人肺組織切片，暴露于流感病毒PR8的刺激下，分別以RNase protection assay(RPA)方法在轉(zhuǎn)錄水平檢測流感病毒刺激后人肺薄片內(nèi)炎癥因子mRNA的表達(dá)，以ELISA檢測流感病毒刺激后的炎癥因子的蛋白釋放，偵測人肺切片對流感病毒

8、的固有免疫應(yīng)答，并以共聚焦顯微鏡免疫熒光方法偵測流感病毒誘導(dǎo)人肺炎癥因子表達(dá)的多細(xì)胞來源。
　　 結(jié)果：流感病毒刺激后的人肺中流感病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了多種類的炎癥因子，在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)MIP-1α和IP-10 mRNA存在高表達(dá)，并在翻譯水平證實了流感病毒刺激引起誘導(dǎo)生成炎癥因子蛋白釋放增加。共聚焦顯微鏡免疫結(jié)果表明，由流感病毒誘導(dǎo)生成的多種細(xì)胞因子反應(yīng)是來源于人肺上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的多種細(xì)胞公共參與的固有免疫反應(yīng)。

9、>　　 結(jié)論：流感病毒引起人肺內(nèi)激活多種固有細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子反應(yīng)，誘導(dǎo)生成的MIP-1α和IP-10等多種炎癥因子參與了流感病毒感染后啟動的人肺固有免疫應(yīng)答。
　　 第四部分：CSE抑制流感病毒觸發(fā)的人肺固有免疫。
　　 目的：進一步明確流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(PR8)感染體外移植培養(yǎng)人肺薄片后人肺多種固有細(xì)胞參與誘導(dǎo)細(xì)胞因子和抗病毒因子生成的固有免疫應(yīng)答。評價香煙煙霧提取物(Cigarette Smo

10、ke Extract，CSE)在人肺器官培養(yǎng)模型上對流感病毒引起的細(xì)胞因子的影響并探討其可能的作用機制。
　　 方法：采用標(biāo)準(zhǔn)流程獲得的香煙煙霧提取物(CSE)處理人肺薄片組織，以ELISA方法檢測流感病毒PR8誘導(dǎo)的多種炎癥因子蛋白的表達(dá)及CSE對炎癥因子蛋白表達(dá)的影響，明確CSE是否對流感病毒誘導(dǎo)的人肺固有免疫存在抑制作用；進而以RT-PCR檢測CSE處理或聯(lián)合抗氧化劑處理對流感病毒感染后誘導(dǎo)的炎癥因子及PRRsmRNA表達(dá)

11、的影響；再以Western blot檢測CSE處理或聯(lián)合抗氧化劑對流感病毒刺激后人肺RIG-Ⅰ蛋白表達(dá)的影響。另外，以LDH釋放毒性實驗測定CSE對人肺切片的細(xì)胞毒性。
　　 結(jié)果：在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平發(fā)現(xiàn)CSE減弱流感病毒觸發(fā)的人肺細(xì)胞因子反應(yīng)以及RIG4-ⅠmRNA和蛋白的表達(dá)，適宜濃度CSE處理是安全的。同時發(fā)現(xiàn)，CSE對RIG-Ⅰ及其它PRRs信號通路的抑制作用可被抗氧化劑保護。
　　 結(jié)論：CSE減弱流感病毒觸