天然免疫分子Tetherin的克隆、表達及對流感病毒復制的影響.pdf

1、背景及目的：
　　1.Tetherin是具有特殊拓撲結構的脂筏相關跨膜蛋白,2008年發(fā)現(xiàn)其可抑制逆轉錄病毒的出芽釋放,對多種包膜病毒具有潛在的抑制作用。流感病毒是有包膜的單鏈RNA病毒,與HIV、Ebola等包膜病毒類似,為此本研究對Tetherin基因進行了克隆及表達,并研究Tetherin的非特異性抗病毒機制及與對流感病毒復制的影響。
　　2.有絲分裂檢查站關鍵蛋白Zwint-1缺失不會停止正常細胞有絲分裂,卻造成染色

2、體過早的分離,引起非整倍體癌變。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)新的Zwint-1變異體(Zwint-1v)存在。本實驗利用細胞周期同步化技術使HeLa細胞分別處于間期與分裂期,分析HeLa細胞不同細胞周期中Zwint-1及Zwint-1v蛋白的定位及隨細胞周期變化情況。
　　材料與方法：
　　1.提取人外周血單個核細胞RNA,RT-PCR克隆Tetherin基因,并構建其真核表達質粒。
　　2.脂質體法在MDCK細胞中轉染Tet

3、herin表達質粒,間接免疫熒光檢測Tetherin蛋白的表達及亞細胞定位。
　　3.脂質體法轉染和G418篩選穩(wěn)定表達Tetherin及空載體的MDCK細胞,經(jīng)流感病毒PR8感染后,利用CCK-8法測定病毒感染后細胞的增殖動力曲線,檢測細胞對流感病毒的抵抗作用。
　　4.空斑法及血凝試驗及RealtimePCR檢測流感病毒PR8在篩選穩(wěn)定表達Tetherin及空載體的MDCK細胞中的復制動力曲線。
　　5.脂質體法轉

4、染HeLa細胞,瞬時表達Zwint-1及Zwint-1v,胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步化HeLa細胞,在不同細胞周期,利用間接免疫熒光及細胞核染色檢測其亞細胞定位。
　　結果：
　　1.酶切及DNA測序結果表明所克隆的人Tetherin基因與GenBank序列一致,其表達質粒的構建與預期設計相符;免疫熒光結果表明其重組蛋白主要分布于細胞膜上。
　　2.間接免疫熒光及流式檢測表明成功構建穩(wěn)定轉染Tetherin及其空載體的M

5、DCK細胞系。
　　3.CCK-8檢測結果表明,在感染PR8病毒后,穩(wěn)定轉染Tetherin的細胞活力高于空載體的細胞,感染后36h,差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.空斑實驗及血凝試驗結果表明,在感染各時間點,穩(wěn)定轉染Tetherin的MDCK細胞上清中,PR8病毒的滴度與空載體對照細胞的感染上清滴度無差異。
　　5.Real time PCR結果顯示Tetherin在24h,36h細胞內(nèi)病毒含量高于空載體。
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6、.免疫熒光結果表明,HeLa細胞間期,Zwint-1野生型定位于細胞質,Zwint-1v主要定位于細胞核;分裂期,Zwint-1及Zwint-1v大部分轉移到細胞核的紡錘體及著絲粒上;Zwint-1v與Zwint定位不完全相同,且Zwint-1v更趨近于細胞核。
　　結論：
　　1.成功克隆和表達人Tetherin基因,構建了穩(wěn)定表達細胞系,重組表達Tetherin的細胞可有效抵抗流感病毒對細胞的破壞作用,并影響子代病毒的釋