天然免疫分子Tetherin的克隆、表達(dá)及對(duì)流感病毒復(fù)制的影響.pdf

1、背景及目的：
　　1.Tetherin是具有特殊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的脂筏相關(guān)跨膜蛋白,2008年發(fā)現(xiàn)其可抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒的出芽釋放,對(duì)多種包膜病毒具有潛在的抑制作用。流感病毒是有包膜的單鏈RNA病毒,與HIV、Ebola等包膜病毒類似,為此本研究對(duì)Tetherin基因進(jìn)行了克隆及表達(dá),并研究Tetherin的非特異性抗病毒機(jī)制及與對(duì)流感病毒復(fù)制的影響。
　　2.有絲分裂檢查站關(guān)鍵蛋白Zwint-1缺失不會(huì)停止正常細(xì)胞有絲分裂,卻造成染色

2、體過早的分離,引起非整倍體癌變。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)新的Zwint-1變異體(Zwint-1v)存在。本實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞周期同步化技術(shù)使HeLa細(xì)胞分別處于間期與分裂期,分析HeLa細(xì)胞不同細(xì)胞周期中Zwint-1及Zwint-1v蛋白的定位及隨細(xì)胞周期變化情況。
　　材料與方法：
　　1.提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞RNA,RT-PCR克隆Tetherin基因,并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　2.脂質(zhì)體法在MDCK細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Tet

3、herin表達(dá)質(zhì)粒,間接免疫熒光檢測(cè)Tetherin蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位。
　　3.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染和G418篩選穩(wěn)定表達(dá)Tetherin及空載體的MDCK細(xì)胞,經(jīng)流感病毒PR8感染后,利用CCK-8法測(cè)定病毒感染后細(xì)胞的增殖動(dòng)力曲線,檢測(cè)細(xì)胞對(duì)流感病毒的抵抗作用。
　　4.空斑法及血凝試驗(yàn)及RealtimePCR檢測(cè)流感病毒PR8在篩選穩(wěn)定表達(dá)Tetherin及空載體的MDCK細(xì)胞中的復(fù)制動(dòng)力曲線。
　　5.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)

4、染HeLa細(xì)胞,瞬時(shí)表達(dá)Zwint-1及Zwint-1v,胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步化HeLa細(xì)胞,在不同細(xì)胞周期,利用間接免疫熒光及細(xì)胞核染色檢測(cè)其亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果：
　　1.酶切及DNA測(cè)序結(jié)果表明所克隆的人Tetherin基因與GenBank序列一致,其表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與預(yù)期設(shè)計(jì)相符;免疫熒光結(jié)果表明其重組蛋白主要分布于細(xì)胞膜上。
　　2.間接免疫熒光及流式檢測(cè)表明成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Tetherin及其空載體的M

5、DCK細(xì)胞系。
　　3.CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,在感染PR8病毒后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Tetherin的細(xì)胞活力高于空載體的細(xì)胞,感染后36h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.空斑實(shí)驗(yàn)及血凝試驗(yàn)結(jié)果表明,在感染各時(shí)間點(diǎn),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Tetherin的MDCK細(xì)胞上清中,PR8病毒的滴度與空載體對(duì)照細(xì)胞的感染上清滴度無差異。
　　5.Real time PCR結(jié)果顯示Tetherin在24h,36h細(xì)胞內(nèi)病毒含量高于空載體。
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6、.免疫熒光結(jié)果表明,HeLa細(xì)胞間期,Zwint-1野生型定位于細(xì)胞質(zhì),Zwint-1v主要定位于細(xì)胞核;分裂期,Zwint-1及Zwint-1v大部分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的紡錘體及著絲粒上;Zwint-1v與Zwint定位不完全相同,且Zwint-1v更趨近于細(xì)胞核。
　　結(jié)論：
　　1.成功克隆和表達(dá)人Tetherin基因,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,重組表達(dá)Tetherin的細(xì)胞可有效抵抗流感病毒對(duì)細(xì)胞的破壞作用,并影響子代病毒的釋