穩(wěn)定表達(dá)牛胰蛋白酶的MDCK細(xì)胞的構(gòu)建及對流感病毒增殖影響的研究.pdf

1、流感疫苗是目前預(yù)防流感發(fā)生和傳播最為有效的手段。傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)流感疫苗系統(tǒng)存在一些不足之處,比如培養(yǎng)的流感病毒易發(fā)生抗原變異,與人群流行株不能完全匹配;殘留卵清蛋白易引起過敏反應(yīng);尤其當(dāng)出現(xiàn)大流行時健康雞胚供應(yīng)受限不能滿足短時間內(nèi)對疫苗的大量需求。而哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能夠避免這些問題,成為未來疫苗生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。臨床試驗(yàn)表明使用 MDCK等細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗是安全的并有高免疫原性,然而較低的病毒滴度是其大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸之一。流感病毒血

2、凝素HA被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1和HA2,才能夠介導(dǎo)病毒囊膜與靶細(xì)胞膜融合,起始病毒生命周期,因此HA的裂解是病毒感染細(xì)胞的首要前提,而MDCK細(xì)胞本身并不具備裂解HA的蛋白酶類,成為產(chǎn)量提升的限制因素。研究證明外加胰蛋白酶能夠有效地提高病毒產(chǎn)量,本研究采取基因工程手段將胰蛋白酶基因?qū)?MDCK細(xì)胞,構(gòu)建能夠自主表達(dá)裂解病毒的蛋白酶的細(xì)胞系,用于疫苗規(guī)?；a(chǎn),簡化生產(chǎn)工藝或更加有效地使疫苗產(chǎn)量提升。
　　胰蛋白酶本身存在

3、酶原和酶兩種形式,而自然狀態(tài)人呼吸道上皮細(xì)胞中,蛋白酶裂解HA可能發(fā)生在胞外、胞內(nèi)或與胞膜相關(guān),為此我們構(gòu)建了酶原和酶兩種形式,分泌、胞內(nèi)、跨膜3種細(xì)胞分布的共6種真核表達(dá)載體?；蚝铣闪送暾呐Ｒ鹊鞍酌副磉_(dá)序列,設(shè)計引物去除 N端分泌信號肽或酶原激活肽的核苷酸序列, PCR擴(kuò)增并克隆了分泌型酶原和酶、胞內(nèi)型酶原和酶的表達(dá)序列;借鑒跨膜絲氨酸蛋白酶HAT基因的跨膜區(qū)TM,設(shè)計引物使TM和胰酶基因各有部分序列重疊,采用重疊PCR擴(kuò)增克隆出

4、跨膜型酶原和酶的目的基因。6條目的序列引入Kozak序列和NheI和EcoRI酶切位點(diǎn),保持正確的開放閱讀框,雙酶切連接至pcDNA3.1真核表達(dá)載體,從而構(gòu)建了3種細(xì)胞分布2種酶型的真核重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　大量提取無內(nèi)毒素高純度的表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,建立了目的基因的瞬時表達(dá)體系。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明載體成功表達(dá)且表達(dá)蛋白大小符合預(yù)期,分別為分泌酶原24.3kD、分泌酶23.4kD、胞內(nèi)酶原24.3kD、胞內(nèi)酶23.4

5、kD、跨膜酶原30.2kD、跨膜酶29.2kD。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示表達(dá)亞細(xì)胞分布正確。以特異熒光底物法檢測各型表達(dá)蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)分泌型酶原的活性最高,轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的MDCK培養(yǎng)甲型流感疫苗株培養(yǎng)72h病毒的產(chǎn)量的增加有統(tǒng)計意義,從而篩選出分泌酶原為重組細(xì)胞活化病毒的最佳表達(dá)作用模式。
　　利用G418抗性篩選和有限稀釋法克隆,通過PCR、RT-PCR及間接免疫熒光鑒定,獲得了穩(wěn)定表達(dá)分泌型牛胰蛋白酶原的細(xì)胞株命名為 MT21。將該

6、單克隆細(xì)胞連續(xù)傳代15代次后仍可保持完整的外源基因,檢測連續(xù)傳代細(xì)胞表達(dá)上清胰酶活性沒有統(tǒng)計差異,目的蛋白表達(dá)穩(wěn)定。
　　將單克隆細(xì)胞 MT21與正常 MDCK細(xì)胞分別在有無外加低濃度(0.5μg/ml) TPCK-trypsin條件下,以0.001的感染復(fù)數(shù)接種野生H1N1、H3N2、B型流感病毒株及甲流疫苗株,收集無血清37℃培養(yǎng)24h、48h、72h的病毒測定NA活性、繪制病毒生長曲線,檢測72h各病毒CCID50滴度,結(jié)果