菲牛蛭胰蛋白酶抑制劑Bdenlin-HM的分離純化及功能研究.pdf

1、目的：
　　胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI）為絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員之一，普遍存在于自然界的動植物及微生物中，能參與調(diào)解體內(nèi)的多重生命活動過程。其中關于胰蛋白酶抑制劑的抗癌作用，是近年來的研究熱點。吸血蛭類在醫(yī)療領域的應用歷史悠久，我國藥用蛭最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》。隨著現(xiàn)代藥理學研究的進展，水蛭的抗腫瘤作用得到了大量實驗研究證實，水蛭提取物以及水蛭中提取的小分子蛋白質(zhì)水蛭素顯示出直接抑制腫瘤生長和增

2、殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成等多方面的抗腫瘤作用。迄今為止，對菲牛蛭及其提取物的研究仍主要集中于抗凝活性、降血脂作用、抗栓和溶栓作用等方面，在抗腫瘤方面的作用少有報道。
　　方法：
　　運用陰離子交換層析（DEAE Sephadex A-50）、反相高壓液相色譜（RP-HPLC）等分離純化手段首次從菲牛蛭的頭部勻漿液中純化得到一個具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白，隨后通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TO

3、F-MS）確定其分子量。通過Edman降解法測定的該蛋白N端部分氨基酸序列，利用測定獲得的氨基酸序列設計特異性引物，從構(gòu)建的菲牛蛭頭部cDNA文庫中擴增得到編碼該蛋白的 cDNA序列。將其編碼序列通過http://web.expasy.org/compute_pi/網(wǎng)站預測獲得其理論分子量，再運用NCBI中BLAST功能以及Lasergene軟件中MegAlign進行序列比對分析其結(jié)構(gòu)特點。通過蛋白酶活性檢測，確定Bdellin-HM對

4、胰蛋白酶，彈性蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，激肽釋放酶，凝血酶，血纖維蛋白溶酶，F(xiàn)XIIa, FXIa, FXa活性的影響，并運用Dixon plot酶動力學曲線計算得出其抑制常數(shù)。
　　結(jié)果：
　?、磐ㄟ^分離純化方法成功獲得胰蛋白酶抑制劑Bdellin-HM的純品。⑵通過菲牛蛭頭部cDNA文庫的構(gòu)建與篩選得到編碼Bdellin-HM的cDNA序列，該序列編碼的成熟肽由149個氨基酸組成，含6個半胱氨酸。網(wǎng)站預測其理論分子量為17,

5、438.04Da，比天然蛋白的分子量大6Da，表明天然蛋白形成了三對分子內(nèi)二硫鍵。⑶結(jié)構(gòu)分析表明，Bdellin-HM屬于Kazal型蛋白酶抑制劑，并同Bdellin B-3以及Bdellin-KL具有高度相似性。⑷酶活性研究顯示，Bdellin-HM具有顯著并專一的胰蛋白酶抑制作用，抑制常數(shù)Ki達到(8.12±0.18)*10-9 M，而對彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽釋放酶、凝血因子（F）XIIa、FXIa、FXa、凝血酶與血纖維蛋