豆粕中胰蛋白酶抑制劑的分離純化及其間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法的研究.pdf

1、胰蛋白酶抑制劑(TI)是豆粕中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子,它抑制人和動(dòng)物腸道內(nèi)胰腺分泌的蛋白水解酶活性,動(dòng)物采食含TI的日糧后導(dǎo)致其采食量和日增重下降,飼料轉(zhuǎn)化率降低,引起胰腺增生和肥大、生長(zhǎng)停滯等問題。ELISA具有選擇性好、靈敏度高、結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn),彌補(bǔ)了經(jīng)典化學(xué)法和其他儀器分析法的不足,目前在飼料安全性檢測(cè)、質(zhì)量評(píng)價(jià)中的研究和應(yīng)用越來越多。
　　 本研究采用與胰蛋白酶偶聯(lián)的CNBr-activated Sephar

2、ose4B通過一步親和層析法分離純化大豆TI,得到兩個(gè)洗脫峰。酶化學(xué)方法檢測(cè)1號(hào)峰比活力為2317TIU/mg,純化倍數(shù)為原液的115倍；2號(hào)峰比活力為5657TIU/mg,純化倍數(shù)為原液的283倍。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),2號(hào)峰表現(xiàn)為20KDa的單一條帶,收集到的蛋白為KTI。1號(hào)峰沒有條帶出現(xiàn),推測(cè)1號(hào)峰收集到的蛋白可能為BBI,因?yàn)锽BI類抑制劑的分子量為6～10KDa,在大分子蛋白膠中未能顯現(xiàn)條帶。
　　 以大豆KTI為

3、抗原采用足掌、腘窩淋巴結(jié)、背部及頸部皮下多點(diǎn)的綜合免疫途徑免疫新西蘭兔,成功制備了高特異性的多克隆抗體。繼而以此抗體為核心試劑,建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為:y=20.841x+50.961,R2=0.9941。選擇0.05mol/L pH8.2 Tris-HCl緩沖液為樣品浸提液,將KTI純品以0.8μg/ml,1.6μg/ml,2.4μg/ml的濃度分別添加到豆粕中,其回收率為93.7％～104.9％,變異系